TritonX-100渗透化处理氧化微杆菌(Microbacterium oxydans CGMCC1788)转化葛根素的研究.pdf

氧化微杆菌（Microbacterium oxydans CGMCC 1788 ） 及其渗透化细胞糖基化葛根素的研究 摘 要 葛 根 素 （ puerarin ， pue ），4,7- 二 羟 基 -8-β-D- 葡 萄 糖 基 异 黄 酮 ( 8-C-β-D-Glucopyranosyl- 7 ,4′-hydroxy -Isoflavone) 目前在临床上已被广泛应用 于心脑血管系统疾病、糖尿病、眼底疾病、突发性耳聋、急性酒精中毒、拟菊 酯类农药中毒及肿瘤等疾病的治疗。但存在如下缺点：1）体内消除速率快，临 床使用剂量较大，口服生物利用度低；2 ）葛根素水溶解度低(6.24 g/L)，注射 制剂大多含有助溶剂以增加制剂的稳定性；助溶剂使不溶性杂质增加，对人体 产生一定的毒副作用，致使用药安全性降低。为了改善葛根素的水溶性，进而 改善其药理活性、提高其生物利用度。利用前药、软药、电子等排等原理对其 结构进行修饰改造，以改善其水溶性和脂溶性，改变其在体内的脂水分布系数， 提高其生物利用度及选择性，最终增强其药理活性，是今后对葛根素研究的重 点。 本实验室丁娟芳、蒋洁蓉等人筛选得到一株氧化微杆菌 M. oxydans CGMCC 1788，通过该菌的静息细胞转化可以将葛根素转化为葛根素-7-O-葡萄 糖苷。 本文对氧化微杆菌细胞采用体积比 1:1 的2% TritonX-100 处理 2 小时，破 坏其细胞膜结构，增加细胞渗透性。用去离子水清洗透化细胞，去除 TritonX-100，按体积比 1:1 加入葛根素 0.2 mg/mL，蔗糖 20g/L ，磷酸缓冲液 (PBS)pH 为 8.0 的转化液，30℃、220rpm 摇床振荡转化 48 小时，高效液相色 谱(HPLC)检测发现得到新的产物产物 1(摩尔百分比 68.75%)，原产物产物 2 即 葛根素 7-O-葡萄糖苷摩尔百分比为 24.90% 。而在 TritonX-100 处理后用 PBS 清 洗透化细胞得到的产物主要为葛根素 7-O-葡萄糖苷(摩尔百分比 41.13%) ，新产 物摩尔百分比为 9.13% 。最优细胞处理条件为用与细胞培养液等体积 2%(v/v) TritonX-100 缓慢旋转处理 2 小时，用等体积水清洗后 12000rpm 离心 15min 收 集菌体，重复洗涤 2 次。最优转化条件为葛根素 0.2 mg/mL，蔗糖20g/L ，磷酸 1 缓冲液(PBS)pH 为 8.0 的转化液，30℃、220rpm 摇床振荡转化 48 小时。去污 剂 TritonX-100 对转化效率有明显抑制作用，因此在用它处理完细胞之后要清 洗干净。处理后的渗透化细胞具有很好的酶活稳定性，在连续转化 2 个月后产 物 1 摩尔百分比仍能高达 62%，160 天后仍然有 20% 。 关键词：生物转化; 葛根素; 葛根素-7-O-葡萄糖苷; 渗透化细胞 2 Biotransformation of Puerarin by Microbacterium oxydans CGMCC 1788 and Its Permeabilized Cells ABSTRACT Puerarin (Pue, 8-C-β-D-Glucopyranosyl- 7 ,4′-hydroxy –Isoflavone) , the most abundant isoflavone in Puerariae radix, is prescribed to treat coronary heart diseases, angina pectoris, cardiac infarction, problems in ocular blood flow, sudden deafness, and alcoholism. Studies