离子交换法.pptVIP

蛋白质的色谱行为 当柱中pH低于蛋白质的pI时，蛋白质带正电荷，不与阴离于交换剂结合,随洗脱液向下移动 。 当蛋白质移动至环境pH高于其pI时，蛋白质由带正电荷变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。 由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境pH 再次低于pI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来而下降 。 移至pH大于pI时又重新结合，直至蛋白质从柱下流出。 不同蛋白质具有不同的等电点，在被离子交换剂结合以前，移动距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。 * 聚焦效应 当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处时，移动速度明显减慢。此时加上相同的第二个样品，它将以洗脱液移动的速度下降，直至追到正在慢移的第一个样品（聚焦）。 如果加入的第二个样品的等电点比第一个样品高，它可以越过第一个样品区先被洗脱出来。 * 二、多缓冲剂 多缓冲剂是一种两性电解质缓冲剂，是分子量大小不同的多种组分的多羧基多氨基化合物。 Polybuffer96 PBE94 Polybuffer74 PBE94 * 三、多缓冲交换剂 PBE94是以交联琼脂糖6B（Sepharose 6B）为载体，并在糖基上通过醚键偶合上配基制成的多缓冲交换剂，是阴离子交换剂。 当Polybuffer96流进多缓冲交换剂时，pH梯度溶液可以自动形成（9—6）。 * 四、操作步骤 （一）凝胶和缓冲剂的选择 PBE94 Polybuffer96 PBE94 Polybuffer74 pH间隔为3个单位。 pH范围应包含要分离样品各组分等电点，并使其有2/3~1/2柱长的吸附解吸时间。 * （二）凝胶柱的准备 （1）凝胶按1∶1悬浮于起始缓冲液中，除气泡。 （2）柱垂直除底部尼龙网下的气泡，关闭柱下端出口。 （3）在柱中放2~3ml起始缓冲液，搅拌下缓缓倒入。 （4）打开柱底部开关，待凝胶沉降后将柱顶部接头装好。 （5）用10~15个柱床体积起始缓冲液平衡。 * 至流出液起始pH和电导系数与起始缓冲液相同 （三）样品的准备 100mg蛋白质/10ml床体积。 样品体积不超过0.5个床体积。 * （四）上样和洗脱 样品均匀平整地加到床面上； 上样前应先加5ml洗脱液。 用洗脱缓冲液淋洗，pH梯度自动形成。 梯度的pH上限由起始缓冲液确定，其下限由淋洗缓冲液的pH决定。 * 避免样品处于极端的pH条件下 去除多缓冲剂的方法 （1）沉淀法 （2）凝胶过滤 （3）亲和色谱法 （4）疏水色谱法 * 多缓冲离子交换剂的再生 多缓冲交换剂的再生可以在柱上进行；用2~3个床体积的1mol/L NaCl淋洗，除去结合物质；用0.1mol/L HCl洗涤，除去结合牢固的蛋白质。 * * * 五、应用实例-蛋白质模拟混合物分离 PBE94柱，床高15cm。 样品:4ml洗脱缓冲液含有马肌红蛋白，碳酸酐酶和白蛋白. 起始缓冲液:0.025mol/L咪唑HCl，pH7， 洗脱缓冲液：多缓冲剂74，pH4。 * 蛋白质的一个模拟混合物的分离 复习思考题 1、离子交换时常用什么方法洗脱？ 2、离子交换树脂的命名法。例举两种树脂骨架。 3、离子交换的选择性与哪些因素有关？ 4、离子交换速度与哪些因素有关？ 5、偶极离子的交换特点是什么？ 6、大孔、均孔树脂的特点是什么？ 7、离子交换纤维素的特点是什么？怎样洗脱？ 8、酸、碱性蛋白如何选用合适的离子交换纤维素？ 9、离子交换聚焦色谱的原理是什么？ 10、术语：DM-C，DEAE-C，PBE94，尼柯尔斯方程，交换带，交换容量，树脂再生，偶极离子排斥，蛇笼树脂 * * 07/16/96 * ## 例如：氨基酸分离前树脂的处理 * 不同类型树脂的处理 * 树脂的再生 树脂再生：使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。 再生过程： （1）?去杂，大量水冲洗，除去物理吸附的杂质。 （2）?用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质。 （3) 转型 * 三、基本操作方法 离子交换操作方法：静态交换和动态交换 洗脱：离子交换完成后将树脂所吸附的物质释放出来重新转入溶剂中的过程。 洗脱方式：分静态洗脱及动态洗脱两种，pH及离子强度改变。 洗脱液：酸、碱、盐。 * 酸、碱洗脱液旨在改变吸附物的电荷或改变树脂吸附基团的解离状态，以消除静电结合力，迫使目的物被释放出来； 盐类洗脱液是通过高浓度的同种电荷的离子与目的物竞争树脂上的活性基团，使吸附物解离。 * 洗脱方式 动态洗脱： 1、 溶液pH及离子强度不变。 2、分阶段改变溶液pH及离子强度。 3、连续改变溶液pH及离子强度。 梯度洗脱：自动化的梯度仪 * 梯度洗脱