山东寿光蔬菜种业集团示范园部分番茄品种褪绿病毒感染探析.docVIP

山东寿光蔬菜种业集团示范园部分番茄品种褪绿病毒感染探析 　　摘 要：番茄褪绿病毒（ToCV）病近几年来在我国各地相继暴发，北方产区染病情况尤为严重。对山东寿光蔬菜种业集团示范园内采集回的27个番茄品种的样品进行RT-PCR检测，结果表明，其中23个品种感染了ToCV；之后对这23个样品进行实时荧光定量PCR检测，分析病毒的CP基因的相对表达量，结果表明，感染品种中ToCV含量存在明显差异；进一步对样品的叶绿素含量进行了检测，结果表明，较难通过叶绿素含量高低判断ToCV的感染程度 关键词：番茄褪绿病毒；PCR；实时荧光定量PCR；叶绿素 番茄是我国和全球最重要的蔬菜作物之一。近年来，番茄褪绿病毒（Tomato Chlorosis Virus，ToCV）病对我国番茄产业形成了潜在的威胁。2012年，北京首次出现该病毒病发生的报道，随后在胶东半岛、天津、河北等地也相继暴发了ToCV[1～3]，目前该病毒病已经在山东省广泛蔓延，使得番茄产量大幅度下降，造成了巨大的经济损失 ToCV属长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒?伲?Crinivirus），该病毒巨大，由2条超过8 kb的RNA链组成。ToCV不能由种子、汁液等途径进行传播，只能由银叶粉虱（Bemisia argentifolii）、烟粉虱（B. tabaci）、纹翅粉虱（Trialeurodes abutilonea）、温室白粉虱（T. vaporariorum）传播，是迄今为止发现的唯一一个可以由2个属的粉虱作为传播媒介的植物病毒[4，5]。在我国，烟粉虱是ToCV的主要传播媒介。1998年，美国佛罗里达州报道发现ToCV[6]。之后，ToCV相继在美洲、欧洲、亚洲以及中东等多个国家和地区蔓延。ToCV不但能侵染番茄，还可以侵染马铃薯、甜椒等其他的园艺作物[7]，为害极大 ToCV在侵染番茄后有较长的潜伏期，一般情况下3～4周内不会表现出明显症状，因此难以发现植株已经染病[8]。而且发病初期的典型症状与缺素症极其相似，容易混淆，具体表现为叶脉间失绿，叶片变厚，但叶脉仍为绿色；发病中期，叶片从边缘向中间坏死；发病后期，整个植株病死，严重影响果实的 质量 目前，对于ToCV的鉴定和检测，主要运用血清学方法[9]和分子生物学方法[10，11]。分子生物学技术中，PCR技术操作简便、灵敏度高，因此被广泛使用。在PCR技术上发展起来的实时荧光定量PCR更是可以高效、快速地鉴别包括ToCV在内的任何植物病毒[12] 山东寿光是“中国蔬菜之乡”，山东寿光蔬菜种业集团示范园是山东有代表性的示范园区之一。2015年示范园种植有800多个品种，当年的示范种植中许多番茄品种出现了叶片皱缩卷曲、边缘黄化等明显的病毒病症状，疑似感染了ToCV。为了确认ToCV的感染情况，从该示范园中取样，通过RT-PCR检测ToCV的外壳蛋白基因CP，分析ToCV的感染情况，进一步通过实时荧光定量PCR检测确定染病品种中CP基因的相对表达量，与此同时还测定了样品中叶绿素含量，以分析ToCV感染程度与叶绿素含量之间的关系 1 材料与方法 1.1 试验 材料 2015年12月6日，从山东寿光市蔬菜种业集团示范园采集27个番茄品种的样品，编号为1～27号（表1）。其中编号为2、3、27号的材料表现较好，无明显疑似ToCV症状，而编号为1、11、23号的材料表现较差，其叶片明显变黄，具有明显的疑似ToCV症状。部分材料症状有较为明显的分离，如编号为9、10号的植株。同时采集了显症明显的9号和未显症状的样品10号，全部样品保存在-80℃冰箱中备用 1.2 试验方法 ①样品总RNA的提取 采用Trizol法提取样品的总RNA。样品在液氮中研磨成粉，用Trizol充分提取之后离心，上清液转移至新离心管后用氯仿充分抽提，再次离心，上清液转移至新离心管后用异丙醇沉淀RNA。得到的RNA沉淀用75%乙醇洗涤，离心、干燥后用无RNA酶的超纯水溶解。提取得到的RNA样品用甲醛变性的1%琼脂糖凝胶快速电泳，检测RNA的完整性，用NanoDrop测定RNA浓度 ②RT-PCR扩增 用DNase去除RNA样品中的DNA后，进行反转录（RT）反应，体系如下（20 μL）：RNA样品2.2 μL、HiScriptII逆转录酶2 μL、2×缓冲液10 μL、Actin基因的正向和反向引物（10 μmol/L）各0.3 μL、六碱基随机引物5.2 μL。RT反应在PCR仪上进行，程序如下：25℃ 5 min，50℃ 15 min，85℃ 5 min。反转录完成后得到的cDNA加入40 μL ddH2O稀释，保存于-20℃备用 利用Actin基因的引物检测RT反应的质量，