以非那西丁为探针采用高效液相色谱法快速测定细胞色素P450 1A2的酶活性论文.docVIP

　　以非那西丁为探针采用高效液相色谱法快速测定细胞色素P450 1A2的酶活性论文 【摘要】 目的建立一种快速、高效的以非那西丁作为探针药物评价细胞色素P450 1A2（CYP1A2）酶活性的高效液相色谱-紫外检测方法。方法色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（50 mm×4.6 mm I.D.，5 μm）；流动相为乙腈-水（含0.01％七氟丁酸），梯度洗脱，流速2.0 ml·min-1；检测波长为244 nm。非那西丁与人CYP1A2酶在37 ℃温孵适当时间后，加入50 μl乙腈终止反应，10 000 g离心后取上清液进样分析测定。结果对乙酰氨基酚的保留时间为2.85 min，线性范围为1.00～200 μmol·L-1（r=0.999 9），最低定量限（LLOQ）为1.00 μmol·L-1.freelin，线性范围为1.00～200 μmol·L-1（r=0.999 9），最低定量限（LLOQ）为1.00 μmol·L-1，回收率为98.3%～101.1%。两者的日内、日间相对标准偏差均小于15%，温孵体系中的其他内源性物质不干扰测定。结论该方法快速、稳定、灵敏度高，适合体外非那西丁及其代谢物对乙酰氨基酚的测定，可应用于体外CYP1A2酶活性的评价及酶动力学的研究。 【关键词】 高效液相色谱法； 非那西丁； 对乙酰氨基酚； 细胞色素P450 1A2 Abstract：ObjectiveTo develop a method for the evaluation of cytochrome P450 1A2 activity using phenacetin as the probe pound in vitro by high-performance liquid chromatography-ultraviolet detection (HPLC-UV). MethodsAn Agilent Zorbax SB-C18 (50 mm×4.6 mm I.D., 5 μm) column obile phase consisted of acetonitrile and l·min-1, and the UV detector . Firstly, phenacetin an CYP 450 1A2 enzyme in vitro at 37℃ and stopped by addition of 50 μl acetonitrile and centrifuged (10 000 g) for 3 min. Finally, the supernatant e of acetamidophenol in. The linear calibration curves of acetamidophenol ol·L-1 (r=0.999 9). The loit of quantification (LLOQ) of acetamidophenol ol·L-1. The average recovery e of phenacetin in. The linear calibration curves of phenacetin ol·L-1 (r=0.999 9). The loit of quantification (LLOQ) of acetamidophenol ol·L-1. The average recovery ination of the analytes of interest.ConclusionThe method is simple, rapid and suitable for the evaluation of cytochrome P450 1A2 activity in vitro. Key idophenol; Cytochrome P450 1A2 细胞色素P450 1A2（CYP1A2）是最重要的P450酶之一，参与多类药物的代谢，其在人体中的表达具有组织特异性，CYP1A2主要在肝脏表达，准确地评价CYP1A2的酶活性十分重要［1～3］。咖啡因N3-去甲基代谢是常用的CYP1A2标志反应。但利用基因重组的CYP1A2酶研究发现，该反应具有双相性。只有当咖啡因≤0.1 mmol·L-1时，其代谢才能完全反映CYP1A2活性［4，5］。并且咖啡因的代谢产物难以获得，价格昂贵。因此本研究在体外CYP1A2活性研究中，选用廉价易得的非那西丁作为CYP1A2的探针底物，通过体外代谢测定其在P450酶中的代谢物对乙酰氨基酚（非那西丁O-脱乙基反应，Phenacetin O-deethylation，POD）来评价CYP 1A2酶的活性。本研究建立了快速、高效、稳