二次讨论.docVIP

酶工程第二次讨论课报告 生物技术091 方言康 2009016257 一、酶的分离纯化过程中要注意的问题 在酶分离纯化过程中，一个非常重要的问题是保护酶的活性，不使酶在纯化的过程中失活，因此酶提取纯化应注意以下问题： 　　1. pH值，选择酶最稳定的pH值，确定合适的缓冲容量的缓冲溶液； 　　2. 温度，一般来说0时酶比较稳定，一般在0～4时操作；但有例外，如丙酮酸羧化酶，在0时不稳定，而在260时稳定； 　　3. 防止氧化：多含—SH，可加入β-巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等进行保护； 　　4. 避免重金属污染：主要注意溶液的配制，亦可加入EDTA络合去除； 　5. 蛋白酶的污染：加入蛋白酶抑制剂如PMSF（苯甲基磺酰氟）、DFP（二异丙基氟磷酸）或胰蛋白酶抑制剂； 　　6. 介质的极性和离子强度：要求疏水环境可使用蔗糖、甘油等降低溶液的极性；需要提高离子强度的极性介质，可加入KCl、NaCl来调节。 酶活力的测定一般是通过测定酶促反应的速度而确定，而酶催化的反应速度可用单位时间内产物的增加量或底物的减少量来表示。测定方法主要是根据产物或底物的物理化学特性来决定具体的测定方法，分光光度法具有操作简便，时间短，灵敏度高等优点，是一种最重要的酶活力的测定方法。 测定酶活力，实际上就是测定酶促反应进行的速度，酶促反应速度越快，酶活力就越大；反之，速度越慢，酶活力就越小。 2.酶比活力 比活力(性)(Specific Activity)是酶纯度的量度,即指:单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数,一般用IU/mg蛋白质来表示.一 般来说,酶的比活力越高,酶越纯.。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。 总活力的回收率＝纯化后总活力/纯化前总活力*100% 在酶分离提纯过程中，每完成一个关键的实验步骤，都需要测定酶的总活力和比活力，以监视酶的去向。判断分离提纯方法的优劣和提纯效果，一要看纯化倍数高不高，二要看总活力的回收率大不大． 4.酶比活力提高比 酶比活力提高比也就是纯化倍数，纯化倍数=酶制剂的比活力/抽提液的比活力，纯化倍数是判断分离提纯方法的优劣和提纯效果的一个重要指标。 5.示例 一般发表的文章有一个详细的酶活、酶比活力表，下面用一张表来说明： 腺苷酸激酶纯化表（6kg猪肉） 纯化步骤 总蛋白（mg） 总活力(katal) 比活力(katal/kg) 纯化倍数 回收率% 抽提 43500 0.0413 0.95 1 100 调pH 11200 3.25 层析 1716 13.02 凝胶过滤 462 43.17 结晶 344 　 46.5 　 　 　 三、常用的检验酶纯度的方法 超速离心：检测杂质＜5%时不太满意，不适合络合解离体系 电泳：必须在多种pH值下进行，单一pH两种酶可能一起移动 SDS－电泳：可测出分子量，多亚基时会出现多条区带 等电聚焦：检测杂的极灵敏方法，有时会出现表观异质现象 N－末端分析：只适用于一条肽链 免疫技术：高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦