犬瘟热病毒石河子株的初步分离及核衣壳蛋白基因原核表达.pdfVIP

摘要 犬瘟热（canine distemper, CD ）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV ） 感染引起的一种急性、热性、高度接触传染性疾病；是当前对养犬业、毛皮动物 养殖业和野生动物保护业危害最大的动物传染病之一。 本研究根据 CDV 弱毒株 Onderstepoort 的核衣壳蛋白（NP ）基因序列设计套 式 PCR 引物，建立 RT-nested PCR 检测方法。特异性试验表明，该方法可特异 扩增出 CDV NP 基因片段，但其它 RNA 病毒狂犬病病毒（RV ）、DNA 病毒犬 细小病毒（CPV ）以及正常Vero 细胞中均未扩增出目的基因。敏感性试验表明， -3 RT-PCR 可以扩增 10 稀释度的病毒 RNA ，而本研究建立的 RT-nested PCR 可 -6 以扩增 10 稀释度的病毒 RNA ，后者的敏感性明显高于前者。用 RT-nested PCR 对石河子地区疑似感染 CDV 病料的检测结果表明，本研究建立的检测方法，可 以有效的检测CDV 感染，适用于动物 CDV 的快速诊断和流行病学调查。 本研究将患病犬组织研磨上清接 vero 细胞，盲传 5 代后出现细胞病变， RT-nestedPCR 方法检测收获的冻存细胞裂解上清。细胞病变为细胞拉伸拉长， 出现空泡，有的局部细胞明显收缩脱落。PCR 产物电泳出现特异性目的条带， 测序结果显示为 CDV 的特异性核酸序列。与病料中的测序结果进行比对，同源 性为 100%，说明病料接入细胞后，未产生核酸的突变。初步获得犬瘟热病毒石 河子株细胞接毒物。 本研究根据 GenBank 上公布的 CDV 核衣壳蛋白和血凝蛋白基因序列，设计 引物，扩增出 CDV 石河子株的核衣壳蛋白和血凝蛋白基因序列，进行序列比对 分析。结果表明，扩增核衣壳蛋白基因为 1688bp，完整的开放阅读框（ORF ） 为 1572bp，编码 523aa ，与XJ-5(HM596313) 的氨基酸同源性为（100%），但核 苷酸的差异为不同位置的 2 个碱基。扩增血凝蛋白基因为 607bp，编码 202aa ； 与 TN 株（AY390347 ）氨基酸同源性为98.02%，与日本KDK-1 株（AB025271 ） 氨基酸同源性 96.05% 。序列分析结果认为，CDV 石河子株属于亚洲Ⅰ型。 本研究预测 CDV 石河子株 NP 基因 ORF 编码蛋白二级结构，分析其抗原表 位，设计双酶切引物，构建原核表达载体并进行表达。结果表明，核衣壳蛋白存 在明显的抗原表位，成功构建表达载体。优化条件，SDS分析结果显示， 1mmol/L IPTG 诱导 8h，可获得最佳表达，分子量为24.9KDa ，与预计蛋白分子 量一致。为下一步的目的蛋白纯化、NP 免疫特性、结构与功能奠定基础。 总之，本研究从分离犬瘟热病毒入手，分析 CDV 石河子株核衣壳蛋白和血 凝蛋白基因系统进化关系，成功构建原核表达载体并获得表达，得到目的蛋白， 为研究 CDV 核衣壳蛋白的免疫原性、结构和功能关系的奠定基础。 关键词：犬瘟热病毒；RT-nested PCR ；病毒分离；核衣壳蛋白；克隆；表达 I Abstract Canine distemper is a canine distemper virus (Canine distemper virus, CDV) infection caused by an acute, febrile, highly contagious diseases and therefore it is currently one of the most damaging animal diseases on the dog industry, the fur industry and animal breeding wildlife trade.