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ELISA法在植物检测中应用探究及改进措施 　　摘要 酶联免疫吸附法（ELISA）目前是酶联免疫技术中应用最广的方法。详细分析了ELISA的基本原理，并对其基本类型及在植物病毒检测中的应用现状进行了研究。最后在理论分析的基础上结合工作经验，从提高ELISA的灵敏度、保持ELISA检测的稳定性、特异性、检测的标准曲线方法等方面提出改进策略，并对其发展前景进行展望 关键词 酶联免疫吸附法；植物病毒检测；灵敏度；改进策略 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）24-0137-02 早期植物病毒病的检测一般采用传统的生物学方法，而这种单一的生物学检测病毒的方法需要耗费大量的人力和物力，必须培育大量的接种植物，此法不仅费工费时，而且病毒症状表现的时间也较长。因此，寻找灵敏度高、快速、可靠的植物病毒病检测方法迫在眉睫。自从扇叶病毒向草本寄主转接获得成功后，免疫学技术开始蓬勃发展。免疫学技术包括细胞免疫技术、免疫制备技术、免疫血清学技术，其中以血清学技术应用的最为普遍。血清学方法检测植物病毒是利用血清反应原理实现的。由于每一种植物病毒产生的抗血清都有各自的特性，因此通过已知病毒的抗血清可鉴定病毒种类。酶联免疫吸附法（ELISA）是血清学技术中应用最为广泛的一种方法，并已渗透到各个研究领域，该方法是以酶催化的颜色反应来指示抗原抗体的结合[1-2]。由于其具有灵敏、快速、特异性强、分析率高、花费少等优点，可用于大规模样品调查，因此成为检测植物病毒的关键技术 1 酶联免疫吸附法的基本原理 ELISA的基本原理是将酶标记同抗原或抗体物理性地吸附于固相载体表面与酶的催化作用结合，并保持其免疫活性。酶标记的抗原或抗体既保留其反??的特异性，又保留了酶的活性。在测定时，ELISA用固相载体吸附抗原或抗体，固相载体上形成的抗原抗体复合物通过洗涤的方式与液体中的其他物质分开，再加入通过酶标记反应而结合在固相载体上的抗原或抗体，酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，此时待测抗原或抗体与有色产物的量呈一定的比例[3-4]。故可根据底物显色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法具有很高的敏感度 2 酶联免疫吸附法的基本类型 ELISA目前是酶联免疫技术中应用最广的技术。ELISA既可以用来测定抗原，也可以用来测定抗体。在使用酶联免疫吸附法测定时必须具有3种试剂，即固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）、酶标记的抗体或抗原（结合物）、酶作用的底物。从酶联免疫技术建立开始，经过不断的改进，已形成了各种不同类型的检测方法。常用的方法有双抗体夹心法、竞争法和间接法等。这些方法的灵敏度较高、特异性强，已广泛用于病毒的检测 2.1 双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，适用于检测多价抗原。样品中的被检测抗体分子分别与固相载体上的抗原和酶标记的抗原相结合。包被特异性抗体与固相载体连接，经洗涤加入含抗原的待测样品使其与过量固相抗体结合，保温反应，形成复合物。再加入酶标记特异性抗体，保温反应。抗原与酶标记特异性抗体在固相复合物上相结合，洗涤未结合的。加入底物显色，酶催化底物显色，根据显色程度，求出样品中抗原的量（图1） 2.2 竞争法测抗原 小分子抗原可以采用竞争法检测抗原。特异性抗体吸附到固相载体的表面，经过洗涤后分为a/b 2种情况：a组加酶标记抗原和被测抗原混合物，经过温育洗涤后加入底物显色；b组仅仅加入酶标记抗原，经过温育洗涤后加入底物显色。a/b 这2组底物降解量的差就是所要测定的抗原的量（图2） 2.3 间接法测抗体 间接法测抗体也是常常采用的方法之一，酶标记抗体检测各种与抗原相应的抗体。特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。包被抗原经过洗涤加含有抗体的样品温育反应，再洗涤后加入酶标记抗体，温育洗涤后，加入底物显色（图3） 3 酶联免疫吸附法的应用 伴随与其他学科新技术的融合和其本身具有的优点，ELISA得以广泛的应用。ELISA可以用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定溶液中的可溶性抗原。目前，国内外在ELISA 检测植物病毒方面做了大量的研究工作 ELISA在植物病毒中的应用：ElISA技术具有专属性很强的特点，不仅可以测定不同病毒之间的亲缘关系及株系关系，鉴别亲缘关系很近的病毒，还可以对同一种病毒的不同的血清类型区分，有助于测定病毒株系和血清型的分化；可研究植物变异株系的分布情况对植物病毒的流行病学进行研究；ELISA病毒检测是实现无毒化栽培的关键，可以通过对样品的初步检测，筛选脱毒苗木；ELISA可检测植物的真菌和细