AQP4与Kir4.1在大鼠眼内组织的共表达论文.docVIP

　　AQP4与Kir4.1在大鼠眼内组织的共表达论文 陈海，孙善全，汪克建，陈通，谭戈，杨美 【摘要】 目的: 探讨AQP4与Kir4.1在大鼠眼内的定位分布及二者的共表达. 方法: 用免疫组织化学及激光扫描共聚焦显微技术检测AQP4与Kir4.1在大鼠眼内的分布. 结果: 免疫荧光显示，AQP4与Kir4.1在大鼠视网膜和睫状体内的分布形式相似；免疫荧光双标显示，AQP4与Kir4.1在视网膜Müller细胞及睫状突无色素上皮细胞的顶膜面及基底膜面呈重叠分布. 结论: AQP4与Kir4.1在大鼠视网膜Müller细胞及睫状突无色素上皮细胞共表达.freel, Kir)相耦联（coupling ），在脑内水、电解质运输平衡调节中发挥着重要作用. 这种耦联关系与AQP4和Kir4.1在某些胶质细胞特殊膜域的共表达（colocalization）有关［4］. 本实验拟通过免疫组织化学和激光扫描共聚焦显微技术，对AQP4与Kir4.1在眼内组织的定位分布及其共表达情况进行研究，为进一步探讨眼内水、电解质转运平衡及其调节机制提供形态学依据. 1材料和方法 1.1材料成年 PBS漂洗15 min ×3次；500 mL/L甘油-10 mmol/L PBS封片，激光共聚焦显微镜观察. 1.2.3免疫荧光双标记试验10 mmol/L PBS漂洗切片30 min，3 mL/L甲醇-H2O2，10~15 min，0.1 mol/L TritonX100作用10 min；正常山羊血清封闭4 h，37℃，用AQP4一抗(1∶400)，37℃孵育过夜，10 mmol/L PBS漂洗15 min×3次，二抗(FITC标记的羊抗兔IgG) 90 min， 37℃， 10 mmol/L PBS漂洗15 min×3次；正常山羊血清封闭4 h，37 ℃，加另一抗Kir4.1（1∶400），37℃孵育过夜，10 mmol/L PBS漂洗15 min×3次，二抗（Cy3标记的羊抗兔IgG） 90 min，37℃，10 mmol/L PBS漂洗15 min×3次，500 mL/L甘油-10 mmol/L PBS封片，激光共聚焦显微镜观察. 2结果 2.1AQP4在大鼠眼内的分布AQP4阳性着色（绿色荧光）主要集中在视网膜神经层、睫状体无色素上皮细胞）以及角膜内皮细胞、晶状体上皮细胞和虹膜后色素上皮细胞（未显示），其分布主要集中在胞膜，胞质胞核未见显色（图1，2）. A: AQP4免疫荧光标记结果； B: Kir4.1免疫荧光标记结果； C: A/B相应部位的正常形态结构扫描图； D: AQP4与Kir4.1双重标记结果，呈黄色部位为二者的共表达（ONL: 外核层，OPL: 外网状层，INL: 内核层，IPL: 内网状层，GCL: 节细胞层； : 阳性着色的Müller细胞或星形胶质细胞胞体， →: Müller等胶质细胞突起， : 血管周围， ↓: 内界膜， →: 感光细胞外节）. 图1激光共聚焦显微镜下正常大鼠视网膜AQP4（绿色）与Kir4.1（红色）免疫荧光标记结果×400 2.2Kir4.1在大鼠眼内的分布Kir4.1在正常大鼠视网膜内呈明显的阳性表达，尤其是在小血管周围和内界膜等处的表达较强，其分布形式与AQP4的分布相似，阳性细胞胞体位于内核层和神经纤维层，其突起贯穿于整个视网膜神经层，与视网膜Müller细胞和星形胶质细胞的形态一致；此外，Kir4.1在睫状体靠近房水面无色素上皮细胞的基底膜面和顶膜面也有表达，其分布形式与AQP4在上述部位的分布相似（图1，2）. A: AQP4免疫荧光标记结果；B: Kir4.1免疫荧光标记结果；C: A/B相应部位的正常形态结构扫描图；D: AQP4与Kir4.1双重标记结果，呈黄色部位为二者的共表达（→: 睫状突无色素上皮细胞， ←: 睫状突色素上皮细胞）. 图2激光共聚焦显微镜下正常大鼠睫状体AQP4（绿色）与Kir4.1（红色）免疫荧光标记结果×400 2.3免疫荧光双标为进一步探讨AQP4与Kir4.1在上述部位的分布特征，将AQP4抗体与Kir4.1抗体进行免疫荧光双标记. 结果发现，抗AQP4免疫活性和抗Kir4.1免疫活性在视网膜神经层内相叠加，尤其是在内界膜、小血管周围及感光细胞外节处，呈明显的共表达；此外，AQP4与Kir4.1在睫状体的分布也有重叠，二者共表达于无色素上皮细胞（NPE）的顶膜面及基底膜面（图1，2）. 3讨论 水通道蛋白是一组与水通透有关的膜转运蛋白，广泛分布于机体多处涉及水分子快速跨膜转运的部位，在维持体内水、电解质运输平衡中发挥着重要作用［2］. AQP4是脑和眼内分布最多、最广泛的水通道蛋白之一，兼有水运输平衡及渗透压感受器的双重功能，