EBV相关胃癌组织中ras基因突变的检测论文.docVIP

　　EBV相关胃癌组织中ras基因突变的检测论文 孙佰秀 刘薇 张璐 罗兵 【摘要】 目的 探讨EBV感染、ras基因突变在EBV相关胃癌（EBVaGC）发生发展中的作用。方法 应用PCRRFLP技术，分别检测13例EBVaGCs、45例与之匹配的EBV阴性胃癌(EBVnGC)以及58例相应癌旁组织中Hras 12位点，Kras 12、13位点突变情况。结果 检测到2例Hras 12位点突变，突变率为4.44%（2/58），均发生在EBVnGC组织。结论 胃癌组织 ras 基因突变率较低，ras基因突变与EBVaGC的发生无明显相关性。 【关键词】 胃肿瘤；疱疹病毒4型，人；基因，ras ［ABSTRACT］ObjectiveTo analyze the pathogenic role of EBV infection and ras mutations in the development of EBVassociated gastric carcinoma (EBVaGC).MethodsRas gene mutations as (EBVnGC) atched clinicopathological parameters and 58 corresponding adjacent tissues of the cancer.ResultsHras 12 codon mutation as (4.44%), utations in gastric carcinomas is loutation is not related ent of EBVaGC. ［KEY gCl2 5 mmol/L，dNTP 1 mmol/L，AMV反转录酶15 U，核酸酶抑制剂0.5 U，Oligo(dT)15 0.5 μg，模板RNA 5 μL，加NucleaseFree gCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.5 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，DNA模板2 μL，加双蒸水至终体积25 μL。检测Kras 12位点突变的 PCR扩增参数为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 40 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。检测Kras 13位点突变的扩增参数中退火温度调整为50 ℃， 其余参数均与检测Kras 12位点突变相同。检测Hras 12位点突变的PCR扩增参数为：94 ℃预变性5 min；然后，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。取PCR扩增产物5 μL于含溴化乙锭（0.5 mg/L）的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳（80 V，1 h），紫外线投射仪下观察结果，并与PCR Marker DL2000进行对照分析，若分别观察到162、159和170 bp条带表明扩增成功。 1.3.3 限制性酶切反应 检测Kras 12位点突变的限制性酶切反应体系为：10×NEB buffer 2 μL，100×BSA 0.2 μL，BstNⅠ5 U，PCR产物10 μL，最后加双蒸水至20 μL，混匀后60 ℃水浴过夜。检测Kras 13位点突变的限制性酶切反应体系为：10× buffer 2 μL，HaeⅢ 5 U，PCR产物5 μL，最后加双蒸水至20 μL，混匀后37 ℃水浴过夜。检测 Hras 12位点突变的限制性酶切反应体系为：10× buffer2 μL，HpaⅡ 10 U，PCR产物5 μL，加入双蒸水至20 μL，混匀后37 ℃水浴1 h。酶切产物于80 g/L聚丙烯酰胺凝胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外线投射仪下观察结果并拍照。野生型和突变型条带结果判断标准见表1。表1 PCRRFLP检测所用寡聚核苷酸引物和限制性核酸内切酶名称引物序列（略） 2 结 果 本文2例病人检测到Hras 12位点突变，突变率4.44%（2/58），均发生在EBVnGC（图1～3）。Kras 12位点PCR产物大小为162 bp，野生型酶切产物大小为133、29 bp； Kras 13位点PCR产物大小为162 bp，野生型酶切产物大小分别为85、48及26 bp； Hras 12位点PCR产物大小为170 bp，野生型酶切产物大小为66、56及48 bp,突变型酶切产物大小为122、48 bp。 3 讨论 EBV是疱疹病毒科γ亚科的淋巴滤泡病毒，大量血清学研究表明，EBV感染十分广泛，几乎遍及世界各地，成年人的感染率可达98%。EBV具有B淋巴细胞嗜性，能够在B淋巴细胞中建立潜伏感染，并可刺激细胞增生和转化。EBV引起的人类疾