Genistein对人乳腺癌细胞体外侵袭能力的抑制作用论文.docVIP

　　Genistein对人乳腺癌细胞体外侵袭能力的抑制作用论文 焦敏南克俊雷燕张茜孙海凤 【摘要】目的：研究金雀异黄素(genistein)对人乳腺癌细胞株MDAMB231体外侵袭能力的影响并探讨其机制.方法：采用细胞体外侵袭实验系统，观察genistein对乳腺癌细胞体外侵袭能力的影响；应用MP2,MMP9蛋白表达的变化，采用明胶酶谱分析法对药物作用前后乳腺癌细胞分泌的MMP2,MMP9活性进行分析.结果：在药物作用24，48，72h后，15μmol/L组和30μmol/L组侵袭至Matrilgel滤膜下的细胞数分别为（245±12）个，（300±20）个，（378±18）个和（155±20）个.freelol/L组的MMP2蛋白相对值分别为0.71±0.07，0.32±0.06和0.12±0.03；MMP9的相对值分别为0.92±0.06，0.63±0.04和0.24±0.02.明胶酶谱分析结果显示，15，30μmol/L组基质金属蛋白酶活性显著降低(P 0.05).结论：genistein有效抑制乳腺癌侵袭和转移，其作用机制可能与降低乳腺癌细胞运动能力，抑制MMP2，MMP9表达水平与活性有关. 【关键词】乳腺肿瘤；染料木黄酮；侵袭；基质金属蛋白酶类 0引言 金雀异黄素（genistein）是一种植物来源的异黄酮化合物，是大豆中重要的非营养成份，对人乳腺癌细胞、肝癌细胞等多种肿瘤细胞具有体外抗增殖作用［1］，但有关genistein对乳腺癌侵袭转移作用的研究尚少见报道.本研究以人乳腺癌MDAMB231细胞株为研究对象，观察genistein对其侵袭转移的作用并探讨可能的分子机制，为genistein应用于肿瘤临床治疗提供实验依据. 1材料和方法 1.1材料雌激素受体阴性乳腺癌细胞株MDAMB231(美国模式菌种收集中心ATCC细胞库)；genistein，明胶（美国Sigma公司）；鼠抗人MMP2，MMP9mAb（北京中山生物工程公司）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；Q550IEM培养液按1∶20稀释后，取100μL包被Transol/L，37℃孵育24，48，72h后，取出Transol/L，pH7.2PBS淋洗，棉签擦拭微孔膜上层，将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定于20g/L多聚甲醛中30min，Giemsa染色后进行细胞计数. 1.2.2DAMB231传代于100mm的培养皿中，待细胞贴壁后，分别加入浓度为0，15，30μmol/L的genistein，作用48h后，分别提取细胞总蛋白分析.细胞用冷PBS洗涤2次，用300μLRapa裂解液裂解细胞，细胞裂解物-80℃过夜，然后刮取细胞，以12000g，4℃离心15min，收集上清移入新的1.5mL离心管中，考马斯亮兰法定量样本蛋白浓度.依据测定蛋白浓度，取20μg总蛋白进行100g/LSDSPAGE胶电泳，然后电转移至NC膜上.用含有50g/L去脂奶粉的TBST(TBS+1g/L吐温-20)封闭1.5h；分别加入一抗MMP2，MMP9mAb(各按1∶250稀释)，孵育2h，TBST漂洗30min；HRP标记羊抗鼠IgG孵育1h；TBST漂洗30min；ECL显色.同时以βactin蛋白为内参照.EM培养基培养长至60%密度时，镜下观察见细胞贴壁良好，以无血清DMEM洗3遍，每孔再加入DMEM(无血清，含有不同浓度genistein)1mL，继续孵育48h，收集培养上清液并活细胞计数，以3000r/min，离心5min去除细胞碎片，以细胞数为依据调整体积，分装后立刻进行酶谱分析或冻存于-80℃备用. 1.2.4明胶酶谱活性分析将细胞条件培养液上样于100g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶(胶中含1g/L的明胶，明胶是IV型胶原酶底物)，4℃条件下，浓缩胶90V，分离胶140V恒压电泳，电泳后，将凝胶于含有25mL/LTritonX-100的洗脱液内振摇洗涤3次，每次30min.孵育液(50mmol/LTriscl，5mmol/LCaCl2，0.2g/LZnCl2，pH7.5)内37℃孵育18h；1g/L考马斯亮蓝R250染色，300mL/L甲醇、100mL/L乙酸脱色，干燥保存.为了尽量避免误差，每组细胞均设3个以上平行样本，并经多次重复实验. 1.2.5计算机图像分析运用德国产LEICAQ550IDAMB231细胞侵袭能力的影响侵袭实验结果显示，实验组与对照组细胞均能够侵袭至铺有Matrigel滤膜上（图1）.24，48，72h3个时间点上的侵袭细胞数，genistein15μmol/L组为（245±12）个，（300±20）个，（378±18