D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化改变及菟丝子醇提液对其作用的研究论文.docVIP

　　D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化改变及菟丝子醇提液对其作用的研究论文 魏晓东 刘玉萍 李晶 孙洁 欧芹 【摘要】 目的 研究D半乳糖致衰大鼠非酶糖基化作用及菟丝子醇提液对其影响，探讨衰老发生的机制及菟丝子延缓衰老作用的机制。方法 采用D半乳糖制作衰老大鼠模型，观察15、30、45 d时的糖化血红蛋白(GHb)、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)活性的变化。采用半定量RTPCR法测定大鼠胸主动脉糖化终末产物受体(RAGE)mRNA的表达，并观察菟丝子醇提液对其影响。结果 D半乳糖导致GHb、MDA和RAGEmRNA水平升高(P 0.01)，SOD活性降低(P 0.01)，并呈现时间渐进性改变。菟丝子醇提液使大鼠GHb、MDA降低(P 0.01)，SOD活性增加(P 0.01)，RAGEmRNA表达水平降低(P 0.01)。结论 D半乳糖诱导非酶糖基化发生.freell，盐酸镁粉实验鉴定菟丝子醇提液中所含成分。 1.2 动物分组及处理 将67只大鼠随机分为青年组10只，衰老模型组27只，其中15、30和45 d组各9只;模型给药组30只，又分为给药15、30和45 d组每天各10只;各组正常饮食，衰老模型组每日上午按48 mg/kg体重颈背部皮下注射D半乳糖，按0.5 ml/100 g体重灌服温开水;模型给药组除按模型组注射D半乳糖外，每日按0.5 ml提取液/100 g体重灌服菟丝子醇提液，各组眼球取全血，并行颈椎离断，取样液氮保存备用。 1.3 指标的测定 红细胞SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法;全血MDA含量和糖化血红蛋白(GHb)测定采用TBA比色法，测试试剂盒购自南京建成生物工程研究所;大鼠胸主动脉AGE受体(RAGE)表达水平测定：取胸主动脉100 mg液氮中迅速研磨成匀浆，转入装有1 ml预冷Trizol的EP管中，室温静置15 min，加入0.2 ml氯仿，震荡30 s，冰上静置10 min后12 000 r/min,离心15 min，取上清液置另一管中，加等体积冷异丙醇，静置10 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清，用70%乙醇洗2次后，4℃ 12 000 r/min，离心5 min，弃上清，真空离心干燥5～10 min，沉淀用水溶解。RNA样品处理：37%甲醛3.5 μl，10×MOPS 2 μl，RNA样品溶液4.5 μl，甲酰胺10 μl，混匀，68℃温育15 min，冰浴15 min，加入10×上样缓冲液2 μl混匀。采用电泳凝胶成像系统观察RNA分离情况和28 S rRNA与18 S rRNA的情况。采用DU800核酸蛋白检测仪测定RNA纯度。RTPCR法合成RAGE DNA：cDNA反应体系：引物选择Oligo dT18Adaptor Primer按程序操作，5×RNA PCR缓冲液5 μl，无RNA酶H2O 6.5 μl，dNTP 混合物4 μl，RNA酶抑制剂0.5 μl，AMV逆转录酶1 μl，Oligo dT上样引物1 μl，RNA样品2 μl，混匀，移入PCR仪，42℃ 60 min;95℃ 5 min;1循环。PCR反应：采用βactin作内参，引物5′GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′,5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′(扩增产物513 bp);RAGE引物5′ATGAGCAGAGCGGCTATTCC3′，5′CACGCTTCGGTCAGAGCTCA3′(扩增产物530 bp)。94℃ 5 min，1循环，94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃ 80 s;34个循环，72℃ 7 min。PCR产物以凝胶成像系统扫描，测定光密度值并计算RAGE/βactin光密度比值。 1.4 统计学处理 采用SPSS12.0统计分析软件，实验数据用x±s表示，进行方差分析，q检验。 2 结 果 2.1 菟丝子醇提液对大鼠主动脉RAGEmRNA表达的影响和GHb含量的影响 结果见图1、表1。扩增后得到βactin 513 bp和RAGE 530 bp两个片段，βactin与RAGE扩增条件完全一致。图象分析结果显示：与青年组相比模型组和给药组大鼠RAGEmRNA表达增加(P 0.01，P 0.05);与模型组比较给药组RAGEmRNA表达降低(P 0.01)。模型组和给药组各时间点亚组间RAGEmRNA差异显著(P 0.01)。模型组GHb含量明显高于青年组(P 0.01);与模型组相比，给药组30、45 d GHb含量均降低(P 0.01)。模型组和给药组内，与15 d比较，给药30、45 d GHb含量均明显降低(P 0.05)。 2.2 菟丝子醇提液对MDA含