NR2B反义寡核苷酸对大鼠海马CA1区NR2B蛋白质表达的影响论文.docVIP

　　NR2B反义寡核苷酸对大鼠海马CA1区NR2B蛋白质表达的影响论文 .freelal rat hippocampus as a basic approach to the neal rat hippocampal CA1subfield under munohistochemistry to examine the NR2B expression.Results The immunoreactivity of NR2B expression idal and granular cells faintly stained.But the intensity of immunore-activity al tissue，normal saline injection，shame injection and SNR2B injec-tion.Conclusion It is likely that the high basal expression of NR2B in the normal rat hippocampal CA1subfield can be domunohistochemistry;hippocampus;rat N-甲基-D-天门冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）是兴奋性氨基酸的一种特异性受体，不仅与突触发育、兴奋性传递、神经元变性等有关，而且NMDA受体介导的神经兴奋性在缺血性脑损伤中起关键性作用［1］ 。海马是大鼠前脑的重要结构之一，和学习、记忆等一系列重要生理活动密切相关。在严重的短暂性前脑缺血后，海马CA1区将产生迟发性的神经元坏死，而齿状回则对 缺血性损伤具有抵抗作用，不易出现神经元坏死。NMDA受体2B亚单位（NR2B）在海马CA1区的基础性高表达可能是CA1区缺血易损性的原因之一［2］ 。目前，亚单位相对特异性的拮抗剂在选择性保护神经元方面以及毒副反应上存在许多问题［3］ 。反义寡核苷酸技术是目前所知具有精确、高效、特异的基因调节手段。本实验将反义寡核苷酸技术引入干预NR2B蛋白质表达的研究，筛选出针对NR2B mRNA的特异性有效反义寡核苷酸，寻找干预NR2B蛋白质表达的新手段。 1 材料和方法 1.1 NR2B反义寡核苷酸（ANR2B）、NR2B正义寡核苷酸（SNR2B） 根据NR2B的基因序列，用Biognos-tik专用软件设计筛选针对翻译起始区的反义寡核苷酸及相应的正义寡核苷酸，序列为:ANR2B:5′-CTT CAT CTT CAG CTA GTC GG-3′;SNR2B:3′-GAA GTA GAA GTC GAT CAG CC-5′。由美国GIB-CO公司合成。 1.2 试验动物及分组 健康雄性成年SD大鼠，体重250～300g，由徐州医学院实验动物中心提供。实验动物随机分为5组:注射ANR2B组（ANR2B组，n=6），注射SNR2B组（SNR2B组，n=6），注射生理盐水组（NS组，n=6），插针（有生理盐水）不注射组（NSNO组，n=6），正常对照组（不插针、不注射组，NO组，n=6）。 1.3 定位注射 0.4%戊巴比妥钠（10ml.kg）腹腔麻醉，固定于鼠脑立体定位仪上，作颅顶正中切口，以5μl微量注射器经套管连于注射针（外径210μm）作为注射装置，进行立体定位，依据George Paxi-nos的方法，确定海马CA1区立体定位注射坐标为:前囟后3.7mm，旁开1.2mm，深3.6mm。后在相应颅骨凿一小孔，进行定位注射，注射量为5μl（3mmol.L），10min内匀速注射完后留针10min，关闭伤口，饲养48h。 1.4 取材切片 动物用0.4%戊巴比妥钠（10ml.kg）腹腔麻醉，经心-升主动脉快速灌注生理盐水150ml，继之以4%多聚甲醛（pH7.4，4℃）300ml灌注，30min内灌完，灌注后的大鼠断头、暴露脑，在立体定位仪上，将鼠脑冠状位分成前、中、后3段。取含针道的海马中段入原液内后固定（12h，4℃），依次浸入15%、30%蔗糖（各12h，4℃）。做前脑连续冰冻切片，片厚30μm，切片分组收集。 1.5 免疫组织化学反应 ①新鲜配制3%H 2 O 2 （0.3%的Triton X-100.PBS稀释）室温，10min。②10%正常兔血清（0.3%的TritonX-100.PBS稀释），室温，30min。③NR2B多克隆一抗（美国Santa Cruz公司），1∶200，72h，4℃。④生物素化二抗（美国Vector公司），1∶200，12h，4℃。⑤ABC液（美国Vec-tor公司），1∶200，A∶B=1∶1，1h，37℃。⑥二氨基联苯胺（di