PTEN在胃癌细胞中的表达及其CpG岛甲基化状态的研究论文.docVIP

　　PTEN在胃癌细胞中的表达及其CpG岛甲基化状态的研究论文 刘芬，于皆平，邓全军，齐元玲，于红刚 【摘要】 目的 检测抑癌基因PTEN在四种胃癌细胞中mRNA和蛋白表达水平及其 5’启动子区CpG岛甲基化状态。方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应（Methylationspecific PCR,MSP）检测四种不同分化程度的胃癌细胞（HGC27,MGC803,BGC823,SGC7901）中PTEN基因启动子区域甲基化状态，RTPCR和GC803次之(两者间无显著性差异,P 0.05).freela Cells Department of Gastroenterology，Renmin Hospital of ethods Using methylationspecific PCR(MSP) technique to detect methylation status of PTEN gene in 4 different differentiation gastric cancer cells(HGC27,MGC803,BGC823,SGC7901),RTPCR and ethylation 胃癌的发生涉及癌基因功能增强，抑癌基因突变或功能缺失。作为第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因PTEN（Phosphates and Tension homolog deleted on chromosome Ten），在多种肿瘤中存在失活现象，其失活的原因除突变、缺失外，5’CpG岛异常甲基化可能是其失活的第三条途径。本研究采用敏感的甲基化特异性PCR（MSP）方法检测PTEN基因启动子在四种不同分化程度的胃癌细胞中的甲基化状态，并通过RTPCR和GC803,BGC823(低分化),SGC7901(中分化)购自上海生命科学研究院。 1.1.2 主要试剂 Trizol试剂盒，RPMI1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；亚硫酸氢钠，氢醌，鼠抗人βactin抗体，硝酸纤维素膜(Sigma公司)；I1640培养液(pH7.2)，在37℃、5 %的CO2培养箱中培养。 1.2.2 RTPCR检测PTEN mRNA水平 Trizol一步法提取细胞总RNA，经逆转录后再以cDNA为摸板扩增。PTEN基因和βactin的引物序列，见表1。PTEN PCR反应条件：94℃ 3min，以94℃30s，54℃30s，72℃45s循环20次，72℃延伸7min；βactin PCR反应条件：94℃ 3min，以94℃40s，56℃45s，72 ℃60s循环20次，72 ℃延伸7min。1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照并检测吸光度值，将PTEN与βactin吸光度比值作为其mRNA水平的相对值。重复实验6次，取均值。 1.2.3 (终浓度160μM),1×NEBuffer2和1U的Sss1酶共同37℃孵育2h后再经亚硫酸氢钠修饰；完全未甲基化对照仅用亚硫酸氢钠处理；阴性对照分别用没有经亚硫酸氢钠处理的DNA和H2O代替模板DNA进行PCR。 1.2.5 MSP 引物设计根据PTEN基因序列(GenBank accession number AF143312),MethPrimer软件，并参照Salvesen HB,Kang GH,Kang YH等24合成，见表1。25μl PCR反应总体系为：10×Taq酶Buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl(终浓度200μM)，Taq酶0.5μl(1u)，上下游引物各25pmol，MgCL 1.0μl，模板DNA 2～3μl，补足水至25μl。反应条件为：94℃热启动11min后开始35个循环：94℃40s，63℃45s，72℃1min，最后于72℃延伸12min，4℃保存。产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溴化乙锭染色后在紫外光下观察，凝胶成像系统拍照。 1.3 统计学分析 所有数据用±s表示，用SPSS11.5软件进行统计学分析，P 0.05为差异有显著性。 2 结果 2.1 PTEN mRNA和蛋白表达水平 见表2。 mRNA和蛋白水平SGC7901细胞显著高于HGC27细胞(t=18.1536,P 0.01)及MGC803和BGC823细胞(t=9.010,P 0.01；t=7.4567,P 0.01)，后两者显著高于HGC27细胞(t=9.14,P 0.01；t=10.697,P 0.01)，但是MGC803和BGC823细胞之间蛋白表达水平无明显差异(t=1.5535,P 0.05)。如图1、2所示。可见随着胃癌细胞分化程度的降低，PTEN mRNA和蛋白表达逐渐减少，两者呈正相