PCNA的shRNA的真核表达载体的构建及 对子宫颈癌细胞的干预性研究论文.docVIP

　　PCNA的shRNA的真核表达载体的构建及 对子宫颈癌细胞的干预性研究论文 黄浩 凃欣，余南才，吴文莉，刘倩，马威，郝建军，易艳东 【摘要】 目的 构建PA的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在 Hela细胞表达，同时观察PA的shRNA对人Hela细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法 将PA的cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil1,构建真核表达质粒pGenesil1PA14.freelid of Small Hairpin RNA （shRNA） of PA and Investigated the Inhibitory Effect on Hela Cell Key a；Proliferating cell nuclear antigen；Small hairpin RNA；Hela cell 肿瘤的发生与基因突变及细胞增殖有关。增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PA)是在细胞周期S期广泛表达的一种核蛋白,是一种仅在增殖细胞中合成和表达的36KD多肽, 其功能是DNA聚合酶δ的重要辅助蛋白,在DNA合成中是绝对必需的,在细胞增殖过程中有重要意义, PA阳性表达说明该细胞正处于增殖状态。因此, PA作为一项评估细胞增殖状态的指标不仅用于病理学研究,而且近年来在肿瘤研究中的应用日渐增多［1］。 RNA干预（RNA interference,RNAi）本质是一种双链RNA（doublestranded RNA,.freelRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默［2］ (posttranscriptional gene silencing,PTGS)。shRNA是45-50mer的小发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA），通过将其转染到细胞。shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制［3］。 图1 真核表达载体pGenesilPA14的构建 我们根据PA的cDNA的序列设计shRNA的引物，插入真核表达载体pGenesil1,构建正确的真核表达质粒，见图1，导入Hela细胞中并研究其产生siRNA对Hela细胞干预的影响。为RNAi干预技术对肿瘤的基因治疗提供了实验理论和基础。 1 材料与方法 1.1 细胞培养 HeLa细胞引自武汉大学生命科学院,培养于含10％小牛血清的DMEM的培养液中，37℃ 5％的CO2条件下培养，0.3％的胰酶消化和传代。 1.2 shRNA设计和合成 根据PA基因序列(NM_182649)， shRNA设计规则及blast同源搜索选取、设计四对引物及一对对照引物,每一对引物上游含BamHⅠ切点之后GATCC的粘性末端，引物下游互补端含HindⅢ切点的互补的TTCGA粘性末端，武汉市晶赛生物技术有限公司合成。 1.3 PA的shRNA的真核表达载体的构建 将真核表达载体pGenesil1和经BamHⅠ，HindⅢ双酶切后与纯化的含相应粘性末端的PA基因的shRNA四对引物片段和一对对照引物片段,进行线性连接,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经小量提取质粒测序鉴定。构建的表达质粒称pGenesilPA1、pGenesilPA2、pGenesilPA3、pGenesilPA4、pGenesilPAHK。 1.4 阳离子聚合物（梭华－SofastTM/DNA试剂盒）介导的细胞转染 细胞培养至40%～60%汇合，配制不同浓度的pGenesilPA14（浓度 5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml、12.5μg/ml、15μg/ml）梭华－SofastTM/DNA复合物，进行转染，具体操作步骤见试剂盒说明书。 1.5 流式细胞仪(FCM)检测 收集1.0×106细胞,用70%冷乙醇固定,加rNaseA (终浓度50μg /ml),用37℃水浴1h,加碘化丙啶(PI,终浓度20μg/ml),暗处冰浴染色1h。用流式细胞仪检测细胞周期分布,用通过ModFitLT3.1软件分析。 1.6 arker，20pmol为定量单位。 1.7 统计学分析应用 t检验进行差异分析,以P 0.05为差异有显著性意义。 2 结果 2.1 PA shRNA 对细胞增殖的影响 2.1.1 细胞光镜观察见图2、3。由上图可知正常细胞呈致密的上皮，在转染了四种引物的真核表达载体24h后，细胞都发生显著变化，周边细胞脱落死亡，细胞形态呈梭形，中间细胞聚集成团，类似于孤岛状。 2.2 流式细胞仪(FCM)检测细胞周期 见图4A、B。