转基因猪中外源基因拷贝数与整合位点的研究.pdfVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2009, 36(12): 1617~ 1625 转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点的研究* 孔庆然 武美玲 朱 江 格日乐其木格 郇延军 尹 智 牟彦双 刘忠华** (东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030) 摘要 主要采用了绝对定量PCR 和热不均一交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR) ，检测了体细胞核移植 技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点，并利用旁侧PCR(Junction PCR)对整合位点进行确定，同 时进一步分析了整合位点的纯合性 结果表明，绝对定量PCR 可以准确有效地检测外源基因拷贝数，标准曲线为：log N (拷 2 贝数) 0.935 4 3.4 11 6 ( 2 0.997 4 ， 0.00 1)，两只转基因猪中外源基因拷贝数分别为30.85 1.77 和 18.87 1.34 ； =- Ct + R = P 依 依 TAIL-PCR 能成功地克隆转基因猪中外源基因整合位点，得到25 条特异性条带，经BLAST 比对，共获得TgInS 1 (1 440 bp) 、 TgInS2 ( 1 263 bp) 和TgInS3 (1 861 bp) 3 个整合位点 以整合位点侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合引发 Junction PCR，得到预计大小的特异性片段，确定了整合位点上、下游侧翼序列的准确性 采用整合位点5 上游和3 下游侧忆 忆 翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合，进行Junction PCR，在两只转基因猪中都得到与野生型猪一致的侧翼序列 特异性引物扩增片段，表明我们获得的转基因猪都为整合位点杂合子 初步建立了绝对定量PCR 和TAIL-PCR 对外源基因 拷贝数和整合位点检测的体系，为今后研究外源基因在转基因猪中遗传和表达的稳定性打下了基础 关键词 转基因猪，拷贝数，整合位点，绝对定量PCR，TAIL-PCR，纯合性 学科分类号 Q7 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2009.00326 近 10 年来，通过转基因技术与体细胞核移植 不高，非特异反应过多，操作复杂等问题没有被广 技术的结合使转基因动物生产得到了长足的进展 泛应用 热不均一交错 PCR (thermal asymmetric [1, 2] [11] 目前，人们已获得多种 型的转基因克隆牛 、 interlaced PCR，TAIL-PCR) 是由Liu 等 设计的， [3, 4] [5～8] 羊 和猪 等，本实验室也于2006 年获得了我国 其利用3 个嵌套的特异引物(SP primer)分别和一组 首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪[9] 确定外源基因 较短的随机简并引物(AD primer) 组合引发巢式 的拷贝数和整合位点是 功建立转基因动物模型后 PCR 扩增 这种方法可以高效获得较长的侧翼序 的首要步骤，也是后续表型研究和基因功能探讨的 列、且特异性高、操作简单 前提条件 据此，本研究建立了实时定量PCR (real time 在转基因动物中，对外源基因拷贝数的检测一 PCR)和TAIL-PCR 检测绿色荧光蛋白转基因猪中 直是个难题 DNA 印迹杂交法是鉴定外源基因拷 外源基因拷贝数和整合位点的方法，并进一步应用 贝数的传统方法，但费时费力，且只能做到半定 旁侧PCR(Junction PCR)对整合位点进