5章 DNA的复制.ppt

2、真核生物DNA复制的控制—复杂 真核生物的细胞分裂周期，染色体的复制在S期进行，第一个复制子首先被激活，之后其它复制子有序激活。 细胞周期的控制有2个方面： 第一个复制子何时激活 复制起动时多个复制子顺序 A、受细胞周期调节 G1 preparing for DNA replication (cell growth) S DNA replication G2 a short gap before mitosis M mitosis and cell division Cell cycle Entry into the S-phase: Cyclins Cyclin-dependent protein kinases (CDKs) signaling B、染色体水平的调节 常染色质先复制，异染色质后复制 C、复制子水平的调节 复制起始复合物的形成、RNA引物的合成等 促分裂剂、致癌剂可促进复制的起动 天然物质主要有黄曲霉毒素、环孢素A、烟草和烟气、槟榔及酒精性饮料、苯巴比妥促肝癌；色氨酸和糖精促膀胱癌；DDT、二恶英（垃圾焚烧、含氯化学品的杂质、纸浆漂白和汽车尾气）等 第四节 PCR聚合酶链式反应 一、原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）又称DNA体外扩增技术，由Karly B. Mullis等在1984年发明，原理与DNA复制相似。 PCR技术是在试管中以DNA为模板，利用两条脱氧寡核苷酸引物分别与特异的DNA片段的正链和负链互补，经过模板DNA变性后，模板DNA和引物复性，在DNA聚合酶催化下，发生引物链的延伸反应，引物的延伸产物与原来的模板DNA经过加热变性后，作为新的模板并与另一引物互补，在聚合酶作用下又发生引物链的延伸反应，如此反复循环，可使特异DNA区段成几何级数倍增，在几小时内合成百万拷贝以上的目的DNA（2n）。 变性 变性 退火 延伸 退火 延伸 20=1 22=4 二、扩增过程： 目的双链DNA ↓94℃变性 开链DNA ↓37-55℃退火 循环n次（n=30-35） 引物与模板链结合 ↓72℃延伸反应 复制使子链延伸 三、PCR反应体系 （一）引物：一般长20-30bp的核苷酸单链，根据需要可在5-40bp之间选择，越长的引物，特异性越高，在反应前合成。 选择引物的原则： 1 尽可能选择随机碱基分布和G-C含量接近的DNA片段为引物。 2 尽量避免选择带有多聚嘌呤或多聚嘧啶的片段如Poly A，PolyT等以及其它异常序列的引物。 3 避免选择带有显著重复序列结构的片段为引物，尤其在引物的3`-端。 4 合成的两条引物之间不应有互补序列，不能形成发荚结构。 5 引物不必与目标链完全配对，但3`-端最后几个碱基必须完全配对，最好以A、T结尾。 （二）DNA聚合酶 最初PCR用大肠杆菌klenow大片段，该酶对热敏感，循环一次要加入新的酶。1986年A Chien从嗜高温细菌Thermur aquaticus提取了耐高温DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶（PE公司占专利，Promega公司有使用权），现有售重组的Taq DNA聚合酶。 目前发现的Taq DNA聚合酶分二类： 1 普通型：95℃半衰期6-7小时，100℃以上，1.8小时，便宜； 2 耐温型：95℃半衰期23-24小时，100℃以上，8小时，贵 普通型常用，Taq DNA Pol催化PCR时会使3`-端带一个A，不是目的DNA上固有的碱基，因此设计有T载体，以工程质粒切成平端，在每端的3`-端加上一个T，以与PCR产物3`-端所带的A互补，用于外源基因的克隆；即T-A克隆。 （三）模板DNA 任何物种、方法、来源、组织获得的DNA均可作为模板。 (四)目标DNA：一般以1Kb为宜，目前已能做到扩增50Kb以上。 （五）四种脱氧三磷酸核苷（dNTP）、Tris.Cl, Mg2+等。 四、PCR的应用： 1、扩增特异性的DNA片段和基因 2、分子病的论断 3、分子流行病学检验 4、突变的检验 5、性别鉴定 6、分子进化 7、DNA标记辅助选择 8、鉴定癌症的治疗效果和基因治疗的周期。 GH： 1903bp = 5`UTR（313bp） （1573bp） + 3`UTR（17bp） GenBank No. DQ086832 Lane 1：λDNA/HindIII-EcoRI marker； Lane 2 ：重组质粒/Hind III ； Lane 3：pBluscriptS.K/Hind III