大鼠大脑皮质神经元细胞模型材料制备.pdfVIP

实验动物科学与管理 21洲拓年第23卷 增刊 L肉ROF八TOPYANIMAL引二IENCE冉ND MANACEMENT ·115. 大鼠大脑皮质神经元细胞模型材料制备 霍桂桃，赵德明’于宋振2尹晓敏，周向梅，马李颖 (1.中国农业大学国家海绵状脑病实验室，北京 1州1珍4;2.北京市兽医卫生监督检验所，北京 1仪犯22) 动物传染性海绵状脑病(呼 mssibliePos呼- 于胞体的起始处，常呈锥形，其内无尼氏体，着色浅， 肠nllnece户alPaohties)是由肮病毒(Prino)引起的中 此部即轴丘;背景无着色。经抗NSE特异性单克隆 枢神经系统感染的一系列疾病，如人的克一雅氏病、 抗体和罗丹明标记的兔抗鼠二抗染色后，荧光显微 羊痒病、疯牛病等jl[。动物飞E的发生给世界公共 镜下可见NSE抗体阴性的对照未见到荧光标记的 卫生安全造成极大威胁。虽然各国科学家几十年来 神经元，阳性神经元胞体和轴突均染成红色。神经 致力于动物飞E，的研究，但正常细胞内PrpC的功 元形态正常，生长良好。培养4d的大鼠大脑皮质神 能至今仍不甚清楚，发生错误折叠的肮蛋白的致病 经元阳性率在90%以上。纯培养的神经元采用有 机理仍在探索之中[2一5」。动物传染性海绵状脑病的 丝分裂抑制剂5一氟脱氧尿嗜陡处理，可以抑制非 主要病变是神经系统病变，如神经元空泡化、胶质细 神经细胞分裂增殖，从而获得较纯的神经细胞。Ara 胞增生等。神经细胞培养是研究神经细胞形态及病 一。也可用作有丝分裂抑制剂，但A、一。不能完全 理变化常用的方法之一，是研究中枢病变的有效系 抑制非神经细胞的生长，且对神经元具有毒副作用。 统;神经细胞是prino在脑部的主要表达部位，因此 作者在制备皮质神经元细胞模型材料中采用5一氟 神经细胞是理想的研究PrpC的生理功能和Prps致 脱氧尿嗜睫来抑制非神经元的增殖，更能反应细胞 病机理的材料。神经元是有丝分裂后的细胞，不同 试验的可靠性。但需注意的是，5一氟脱氧尿嗜吮要 于其它细胞系，在体外具有较长的生存期，因此在体 在神经元生长48h加入，且只加一次，浓度控制在 外进行神经细胞培养，建立细胞模型是研究Prpc以 ro林mol·L一，‘以后用正常培养液培养。常规的细 及PPr阮作用的有效系统。我们参照前人]’[培养大 胞消化分离法在细胞经胰蛋白酶消化后直接用含血 脑皮质神经元的方法，结合实验室预备试验，对大鼠 清的培养液终止酶消化，然后用吸管吹打分散，分散 大脑皮质神经元进行体外原代培养，为制备研究传 效果不好，细胞相互粘连成团;在本试验中，在细胞 染性海绵状脑病的细胞模型奠定基础。培养的神经 消化结束后加人了DNasel，防止由于细胞破碎释 细胞经甲苯胺蓝染色和免疫荧光染色鉴定。结果显 放的DNA 将细胞粘集在一起，有利于细胞分散，收 示，倒置显微镜下可见培养的神经元生长发育正常， 获更多的细胞。另外用胰蛋白酶消化组织分离细胞 42h神经元细胞突起增多，48h后细胞变成锥形或 时，用D一Hank’。配制的胰蛋白酶的pH为8.0，这 梭形，72h后，由于加人5一氟脱氧尿啼吮，胶质细胞 样在消化后残留的胰蛋白酶溶液不会对培养液的 大部分死亡，溶解。神经元突起明显变长，与邻近神 pH造成明显变化。本试验采用甲苯胺蓝染色法显 经元的胞体或突起连接，神经网络基本形成。4一5 示，神经元的神经网络发育良好，细胞体的形态符 d后，神经元胞体继续增大，神经突起长度和数量增 合大脑皮质神经元的特征，从侧面证实培养的神经 加，基本铺满皿底。甲苯胺蓝染色闭后可见神经元 元生长良好。免疫荧光鉴定证实细胞的纯化率较 生长良好，均匀分布。镜下可见神经元的细胞核大、 高，可以用作进步研究动物海绵状脑病细胞模型材 圆形、色浅、核仁清楚;着深蓝色大小不等的小块或 料。 颗粒状，即尼氏体，其分布于核周质及树突内。轴突 拓金项目:北京市科委项目(及目月1川X冲肠91一)7 作者简介:霍桂桃(197目一)，女，中国农业大学动物医学院博士研究生，研究方向:动物昭a。 通讯作者:赵德明，博士，教授，中国农业大学国家海绵状脑病实验室主任。 实验动物科学与管理 116 】人RORA，DRYANIMALSCEINCEANDMANACEHE卜1】