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RNA提取 RNA 核糖核酸（缩写为RNA，即RibonucleicAcid），存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T。 mRNA 又称信使RNA。mRNA的功能就是把DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，然后再由mRNA的碱基顺序决定蛋白质的氨基酸顺序，完成基因表过程中的遗传信息传递过程。 tRNA 又称转运RNA。如果说mRNA是合成蛋白质的蓝图，则核糖体是合成蛋白质的工厂。但是，合成蛋白质的原材料——20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。因此，必须用一种特殊的RNA——转移RNA（transferRNA，tRNA）把氨基酸搬运到核糖体上，tRNA能根据mRNA的遗传密码依次准确地将它携带的氨基酸连结起来形成多肽链。每种氨基酸可与1-4种tRNA相结合，已知的tRNA的种类在40种以上。 miRNA MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。 cDNA第一链合成 在RT的过程中只合成第一链,因为RT过程是需要逆转录酶,工作温度37℃,同时使用的是随机引物或者是oligo-dT；而PCR过程使用高温DNA聚合酶,工作温度72℃,同时使用的是特异的扩增引物。两个体系没有办法同时进行,就分开来做,那逆转录自然就只转录第一链了。 RNA酶抑制剂 1、焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂，他通过和RNA酶的活性基因团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 2、异硫氰酸胍：目前认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活，它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 3、氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形式过渡类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 4、RNA酶的蛋白质抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胚盘中提取得来的酸性糖蛋白.Rnasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 5、其他：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定的抑制作用。 RNase A 是一种被详细研究和具有广泛应用的5核酸内切酶。RNase A 对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。RNase A专一地催化RNA的核糖在C（胞嘧啶）和U（尿嘧啶）残基下一个核苷酸的5磷酸二酯键裂开，形成具有 2,3-环磷酸衍生物3C或3U寡聚核苷酸。如 pG-pG-pC-pA-pG 被切割产生pG-pG-pCp 和 A-pG。可以用来去除DNA制品中的污染RNA。 它们的合成至今收集到的资料还比较少。 为什么研究RNA 因为DNA信息量非常大.而只有很少一部分会转录成mRNA,在这一过程中占DNA总数90%以上的内含子被切割掉,余下的外显子进而翻译成蛋白质构成生命体.因此直接研究RNA,就是研究了其基因中表达的那部分.省去了很多的工作。一般都是研究mRNA。microRNA 也很热。 RNA提取原理 高浓度蛋白质变性剂(如异硫氰酸胍、盐酸胍等)的裂解方法，是抽提RNA的首选。总RNA的抽提，最重要的是快速裂解细胞，释放出RNA。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的RNA酶，确保了RNA的完整性。除了极少量不适用该方法的样品–主要是植物，其它绝大部分样品的RNA的提取，都基本是以高浓度的蛋白质变性剂为基础。 RNA提取方法 RNA的提取试剂（盒）可以追溯到上世纪80年代，经过20多年的发展，目前已经形成了比较经典的两类试剂（盒）：一类是TRIzol方法（Invitrogen公司最先开发），以异硫氰酸胍和苯酚为裂解液主要成分的一步法RNA提取试剂；另外一类Qiagen公司开发的：以胍盐和β-巯基乙醇进行裂解，不需要酚氯仿抽提，离心柱上用DNA和蛋白酶消化基因组DNA和蛋白，然后漂洗纯化的方法。还有一种综合方法就是在TRIzol基础上加了离心柱，能很好地提高RNA的纯度和操作的重复性和稳定性。最新出现的提取方法是磁珠法。 RNA提取过程 1、样品前处理 2、细胞裂解