2株山东分离株PCV2的全基因克隆和序列分析.pdfVIP

猪传染病 8mol/L尿素进行变性的样品，在加入等体积的复性液后，立即就出现大量絮状沉淀，经缓 慢透析后，沉淀更多，通过离心后将沉淀再用尿素溶解后，采用分步稀释来进行复性，然后 采用逐步降低透析液的尿素浓度的方法进行透析，效果较好，可以提高回收率。一般来说， 碱性pH有利于复性和二硫键的交换，但过碱性环境又会影响蛋白质的活性，故复性体系的pH 一般在8^-9之间。此外，低离子强度也可降低聚集，提高回收率1[121。另外，温度也是影响复 性收率的一个因素，对于gE蛋白，我们发现4℃复性的效果较好.因此，我们确定pETE630复性 的最终条件为:蛋自质量浓度100mg/L,还原型谷肤甘肤浓度为0.9mmol几，氧化型的谷胧甘肤 浓度0.1mmol/L，缓冲液pH8.0,尿素浓度保持在1mol/L，复性温度40C，透析复性时间48h以上。 参考文献略 2株山东分离株PCV2的全基因克隆和序列分析 李俊’王金宝’曹帅2赵鸿雁2丛晓燕z吴家强 (1.山东省农业科学院济南 山东250100;2.莱阳农学院青岛山东266109) 摘 要:对从山东分离到的两株猪圆环病毒采用PCR方法将其全基因序列克隆至pMD18-T载体，刻得其全 基因序列，其中一株病毒全长 1767bp(GenBankAccessionNumberDQ346683)，另一株病毒全长 1768bp(GenBankAccessionNumberDQ478947)，它们之间的核普酸同源性为98.2%,rep蛋白的氛基酸的同源 性为99.4%，与国内外分离株(AF086836,AF109397,AF055391,AF055392,AF055393,AF109398,AF117753, AF166528,AJ223185,AY122275,AY181945,AY181946)的核普酸同源性为79%99.5%，进化树分析表 明:山东两株PCV2与AY181945GD和AF055393U.K.关系较近，处于同一分支;而与国内分离株AY181946 TJ和AY122275HEB关系较远，与美国和加幸大的分离株关系较远。 关链词:猪圆环病毒2型;全塞因;克隆;测序 猪圆环病毒 (porcinecircovirus，PCV)属于圆环病毒科，该病毒有两种基因型即PCV 1和PCV2，前者是德国学者Tische:于1972年在PK-15细胞中发现的一种细胞污染病毒 【1], 由于这种病毒广泛存在于PK-15细胞中，且不引起猪的临床症状，故没有引起人们的重视。 1991年，加拿大西部发生一种新病— 猪断乳后多系统衰竭综合征 (postweaningmultisyst emicwastingsyndrome，PMWS)，其表现为进行性消瘦，呼吸道症状，黄疽，间质性肺 炎，淋巴结炎，肉芽肿，肝炎，肾炎。主要影响5-18周龄的小猪，死亡率在1%-2%, 有时达4%甚至更高 【2]。从发病猪的病变组织中分离到了猪圆环病毒，但这种从病猪体内 分离到的PCV与PK-15细胞污染的PCV基因序列存在很大的差异性，DNA全序列同源性 为76%，从PMWS病例中分离的PCV2毒株的核昔酸同源性高达%%，将这种有致病性的 圆环病毒称为PCV2。近来研究发现PCV2还与猪的皮炎与肾炎综合征，先天性震颤，繁殖 障碍等疾病有关[[3]。美国，法国，意大利，德国，丹麦，荷兰等国均有PCV2相关疾病的 流行，在我国PCV2相关疾病的流行也很普遍，给我国的养猪业造成了较大的经济损失[4]a 我们从山东省发病的儿个疑似猪场中分离到了2株PCV2，并对2个分离株进行了克隆、序 列测定与分析，为山东省PCV2毒株的流行情况、抗原的变异情况研究奠定了基础。 1材料和方法 1.1病毒株 猪圆环病毒2型山东分离株SDI,SD2，由本实验室分离保存。 1.2 主要试剂 TaqDNA聚合酶、dNTP,pMD18-TVector.DH5a,IPTG,X-gal,DL2000Marker均 购自TaKaRa生物技术工程公司，DNA胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司。 1.3引物 参照GeneBank己发表的PCV2分离株40895序列，同时参考M.Fenaux等发表的引物 序列，以Oligo6.0软件设计两对引物扩增全基因序列，由上海生工生物技术工程公司合成。 第六届理事会第二次会议皿教学专业委员会2006年会议论文集