PCV2Cap蛋白重组腺病毒灭活疫苗的制备与免疫效力研究.pdfVIP

猪传染病 PCV2-Cap蛋白重组腺病毒灭活疫苗的制备与免疫效力研究 黄信田，王先炜，李玉峰，冯志新，姜平” (南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京210095) 摘 要:将PCV2-Cap蛋白重组腺病毒 (rAd-Cap)用0.2%的甲醛37℃作用一定时间后接种293细胞，盲 传3代，检浏灭活效果.将灭活的rAd-Cap加入适贡的白油和氮氧化铝胶制成Cap蛋白重组腺病毒油佐剂 和铝胶佐剂灭活疫苗，免疫小鼠，3周后加强免疫一次，分别于一免后21天和35天进行ELISA杭体检测. 为了评价国产油位剂和进口油佐剂的免疚效果，我们还进行了猪体免疚效力试验.通过ELISA抗体、攻毒 后临床表现及体温变化、剖解时的病理变化、平均日增重及病毒血症等指标对疫苗效果进行评价.结果为: D(rAd-Cap能被甲醛完全灭活，灭活时间为14h,②rAd-Cap油佐剂和铝胶佐剂灭活疫苗免疫小鼠后均能 诱导机体产生体液免疫应答，并且油位剂灭活疚苗免痰效果好于铝胶佐剂灭活疚苗.③猪体免疚效力试验 表明，rAd-Cap油苗能够诱导机体产生较高水平的ELISA杭体.攻毒后，攻毒对照猪平均体温高于免疚猪， 空白对照猪体温始终保持正常.并且攻毒后免疫猪及空白对照猪平均体重均升高，而攻毒对照猪平均体重 有所降低，但两免疹组和空白对照组之间平均日增重差异不显著 (P0.05).病毒血症检测及病毒DNA在 组织中的分布检测表明rAd-Cap油苗能够能有效降低猪体的带毒.以上结果表明，rAd-Cap灭活疚苗免疫 小鼠和猪体后均能诱导机体产生免疫应答，并能对猪体产生一定的免疚保护作用. 关键词:Cap蛋白重组腺病毒;甲醛;油佐剂;氮氧化铝佐剂;灭活疫苗 断奶仔猪多系统衰竭综合征 (PMWS)是一种新出现的病毒性疾病，它首先于1991年 在加拿大发生[11，随后在欧洲、美洲及亚洲一些国家的猪群中也发现有本病的存在12-11.PM WS主要感染5-12周龄的猪，临床上主要表现为皮肤苍白、体温升高、渐进性消瘦，同时 伴有呼吸困难、消化不良等症状以及黄疽、间质性肺炎、淋巴结肿大、肝炎和肾炎等病理变 化[[21。据报道，猪群感染本病后，死亡率大约为5-30%[. PCV2被认为是引起PMWS的重要病原，基因组天小为1767by或1768by，含有11个 阅读框。ORF2是其中一个较大的阅读框，编码PCV2主要的结构蛋白[[8,9]，分子量大小为 30-35KD，该结构蛋白的抗原性具有型特异性，并且Cap蛋白是PCV2主要的免疫保护蛋白， 由该蛋白产生的抗体具有中和病毒的作用[10]0 PCV2是一种非常稳定的病毒，它能够在感染的猪群中长期存在，疫苗接种可能是预防 控制PMWS一种较好的方法[[11]。本研究用293细胞增殖rAd-Cap，用甲醛灭活后，与不同 佐剂配制成rAd-Cap灭活疫苗，通过小鼠和猪体免疫试验评价其免疫效果。 1材料与方法 1.1病毒和细胞 PCV2-Cap蛋白重组腺病毒，由本实验室构建和保存;293细胞由本实验室保存。 1.2试验动物 5-6周龄雌性清洁级小鼠，购自南京军区总医院;5周龄PCV2阴性断奶仔猪，购自江 苏高邮某农户家。 1.3重组腺病毒的增殖 将长满单层的293细胞用Hanks液清洗2次，然后接种少量重组腺病毒，37℃吸附0.5h, 加含2%小牛血清的DMEM维持液，继续培养，当细胞有70-80%病变时收毒。 1.4，组腺病毒TCID50的测定 将长满单层的293细胞用胰酶消化成单个细胞后分装于%孔板中，放入CO2温箱中37C 静置培养，待细胞长满单层后，弃掉营养液。用DMEM维持液对重组腺病毒作102-1011连 续稀释，每个稀释度接种5个孔，同时设立阴性对照，放入CO:温箱中37℃继续培养，每天 观察细胞病变。最后按Karber氏法[121计算病毒的TCID5o0 1.5重组腺病毒灭活及灭活效果的检测 向病毒液中加入终浓度为0.2%甲醛，混匀，37℃条件下进行灭活，分别于8h,IOh, 12h,14h,16h取出少量病毒液，加入0.2%的焦亚硫酸钠终止灭活。然后分别取少量不同 ·238- 第六届理事会第二次会议盛教学专业委员会2006年会议论文集 时间段灭活的病毒液接种293细胞，连续盲传3代，观察细胞病变。 1.6孟组腺病毒油佐剂灭活苗的制备 将白油、Span80、硬脂酸铝溶化