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海洋药物学 第四节 提取分离方法及研究实例 一、大环内酯的提取分离方法 大环内酯的提取方法大体分为有机溶剂提取法和碱性溶剂提取法两类。 多选用氯仿、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂进行充分的提取。 碱性溶剂提取法多用0.5%氢氧化钠乙醇溶液或氢氧化钙水溶液提取，使大环内酯变成盐而提取出来。 两种方法所得的粗内酯，再经过重结晶或柱层析比如凝胶柱层析（Sephadex LH - 20），反相硅胶快速柱层析（ODS）和制备性高效液相层析等先进分离技术分离精制。 海洋药物学 海洋药物学 二、分离方法 总合草苔虫Bugula neritina Linnaeus 提取 用95 %乙醇室温浸提一周，共提取4 遍（300 L × 4），合并乙 醇提取液，减压回收乙醇，得浸膏2 kg。 萃取 浸膏用90 %甲醇悬浮分散，用正己烷萃取5次（10 L × 5），得 正己烷萃取物560 g，经体外抗癌活性筛选无活性。 新鲜采集60 kg，干重 海洋药物学 萃取 含水甲醇层再加水使成80 %甲醇水溶液，用CCl4萃取5次（10 L × 5），得CCl4萃取物60 g (IC50 = 7 μg/mL，P388)为活性部位。 层析 该活性部位经快速硅胶柱层析（200-300目）得活性组分2BH-10 （2.7 g，IC50 = 2.4 ?g/mL，P388）。 层析 2BH - 10经过Sephadex LH - 20凝胶柱层析，以CH2Cl2 - MeOH (1：1) 洗脱，流速60 mL/h，得到两个活性组分A (1.7 g, IC50 = 0.3 μg/mL， P388)和B (1.1 g，IC50 = 0.8 ?g/mL，P388)。 层析 对B组分分别进行凝胶柱层析，依次以Hexane - CH2Cl2 - MeOH (4：5：1) 和 Hexane - CH2Cl2 - MeOH (10：10：1)洗脱，分 别得到纯度更高、活性更强的两个组分C (0.7 g，IC50 = 0.1 ?g/ml， P388) 和D (0.5 g，IC50 = 8 ? 10-2 ?g/mL，P388)。 海洋药物学 层析 C、D两组分仍含有较多的绿色素，故将两者合并，进行ODS快速柱层析，以 50%?80%MeOH梯度洗脱，得浅黄色活性组分E (0.8 g，IC50 = 4.8 ? 10- 2 ?g/ml，P388)。 层析 该组分经硅胶柱层析，以Hexane - acetone (5：1?1：1) 梯度洗脱，得到 两个部分F (0.4 g) 和 G (0.2 g)。 HPLC F 经反复HPLC 制备，以83 % MeOH 为流动相，分别得到bryostatin 18 (10 mg)、bryostatin 10 (65 mg)、bryostatin 4 (50 mg)。 层析 G经过一次Lobar柱制备分离，以50 ? 80 ％ MeOH梯度洗脱，得到3个组分 G1 (5 mg)、G2 (12 mg)、G3 (34 mg)。 海洋药物学 层析 G1经反复HPLC制备，以75 ％ MeOH为流动相，得到化合物bryostatin 5 (2.1 mg)。 层析 G2、G3分别经HPLC制备，以85 ％ MeOH为流动相，分别得到 bryostatin 6 (5.8 mg) 和bryostatin 11 (18 mg)。 海洋药物学 三、结构解析 P173-176 以草苔虫内酯4为例 1. 26元环macrolactin 2. 3氧环大环内脂 3. 大环上有3羟基，4个甲基 4. 4个带有酯键的側链 5. 强极性化合物 海洋药物学 一、理化特性 草苔虫内酯4（bryostatin 4），白色无定型粉末，融点198~200℃。 紫外吸收显示bryostatin类大环内酯化合物的特征吸收峰λmax(MeOH)228.7nm。 ESI-MS给出[M+Na+H]+(m/z 918)和[2M+Na+3H]+(m/z 1814)