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羽衣甘蓝亲缘关系分析 　　摘要：采用改良CTAB法得到了可用于RAPD分析的羽衣甘蓝基因组DNA，摸索建立了适合羽衣甘蓝基因组的RAPD反应体系，运用优化的反应体系对羽衣甘蓝新品种的亲缘关系进行了聚类分析。 　　关键词：羽衣甘蓝;CTAB RAPD;亲缘关系 　　 　　收稿日期：2011-04-12 　　作者简介：常 青（1971―），女，辽宁葫芦岛人，高级工程师，主要从事园林规划与管理工作。 　　中图分类号：S635.9 　　文献标识码：A 　　文章编号：1674-9944（2011）06-0175-02 　　1 引言 　　羽衣甘蓝（Brassica oleracea var.acephala f.tricolor Hort.）是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种,两年生草本花卉,又名叶牡丹。其叶形美观多变,心叶色彩丰富艳丽,耐寒性极强,是难得的秋冬季及早春室内外绿化的好材料,现在各地广为栽培［1］。 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）技术是Williams［2］于1990年首先创立的一种DNA分子标记技术。它利用随机的10个碱基的寡核苷酸作为引物,对基因组DNA进行PCR扩增。这些扩增DNA产物片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性［3］。 　　本实验应用RAPD技术从64个随机引物中筛选出适宜的RAPD引物,对14种羽衣甘蓝新品种基因组DNA进行多态性研究,以分析羽衣甘蓝的亲缘关系,为今后配置更加合理的杂交组合提供分子依据。 　　2 材料与方法 　　2.1 供试材料 　　本试验采用从国内外收集的羽衣甘蓝新品种14份,作为供试材料。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 羽衣甘蓝总DNA的提取及检测 　　实验采用改进CTAB法提取羽衣甘蓝基因组DNA,将0.1g嫩叶在液氮中迅速研碎,取0.05g粉末迅速移入1.5mL离心管中,立即加入65℃预热的CTAB提取缓冲液500μL,65℃水浴30min,期间颠倒几次;加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1）抽提2次。取上清液,加无水乙醇,-20℃放置1h。10 000r/min离心;弃上清,加入TE溶解,颠倒混匀,然后再10 000r/min离心;将上清液转入新1.5mL离心管中,加入RNase（10μg/μL）,轻轻混匀后在37℃水浴1h;取出静置,冷却至室温后,加入1/10体积NaAc（pH5.2）和2倍体积无水乙醇,颠倒混匀后-20℃放置1h。10 000r/min离心；弃上清,用70%乙醇洗涤沉淀2次,放置超净工作台上吹干;加入50μLTE溶解；置于4℃备用或-20℃储藏。 　　提取的羽衣甘蓝基因组DNA通过凝胶电泳检测,加样于0.8%（m/v）琼脂糖凝胶（含核酸染料,0.5μg/mL）,在LKB型电泳仪中电泳,并以DNA分子量标准作对照,估测DNA分子量。紫外灯365nm波长下观察、照相。 　　2.2.2 RAPD扩增 　　反应程序为94℃预变性5min;94℃ 变性30s,37℃退火30s,72℃延伸1min,40个循环;最后72℃延伸7min。原始20μL反应体系:2μLlO×PCR反应缓冲液;1.5mmol/LMgCl2;0.2mmol/LdNTP; 0.3μmol/L引物;稀释10倍的总DNA5μL;1UTaq酶;灭菌的超纯水补齐体积到20μL。以上药品均购自TIANGEN生物制剂（北京）有限公司,引物由宝生物工程（大连）有限公司合成,扩增反应在Whatman Biometra GmbH（Germany）公司生产的T-Gradient Thermobolck扩增仪中进行。 　　2.2.3 扩增产物分析 　　扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳,在紫外灯（TCP-15-M型）下观察并照相。将RAPD图谱上清晰稳定出现的条带记为“1”,同一位置没有条带记为“0”,将条带信息转换成由“0”和“1”组成的原始矩阵。应用DPS（version3.01）软件计算各材料间欧氏遗传距离,采用类平均距离法（UPGMA）构建聚类图,分析各品种之间的亲缘关系。 　　3 实验结果分析 　　3.1 提取基因组DNA质量检测 　　通过琼脂糖凝胶电泳,可以得出所提取的样品DNA在20kb左右,没有出现断裂和降解,因此,可用于PAPD的PCR扩增。进一步用紫外分光光度法测得OD260/OD280值均在1.8～2.0之间,表明用改良CTAB法所提取的DNA质量较高,可以满足下游的PAPD反应对模版纯度的要求。 　　3.2 RAPD体系优化 　　在原始RAPD反应体系基础之上,采用单因素法调整反应体系各组分的浓度,摸索建立更加适合羽衣甘蓝的RAPD反应体系。 　　3.2.1 模板浓度的影响 　　为确定适