凋亡蛋白Daxx与TRAF3相互作用的筛选及相互作用位点的鉴定论文.docVIP

　　凋亡蛋白Daxx与TRAF3相互作用的筛选及相互作用位点的鉴定论文 张翠莉，成海恩，王应雄 【摘要】 目的: 利用酵母双杂交技术在成人肝文库中筛选能与死亡结构域相关蛋白（Daxx）相互作用的蛋白，并用哺乳动物细胞中进行了免疫共沉淀验证，以进一步了解Daxx的功能. 方法: 利用PCR在成人肝cDNA文库中扩增Daxx全长ORF，构建pDBLeuDaxx载体. 转化MaV203，检测细胞毒性和自激活作用，确定His基础表达的3AT浓度. 依次转化成人肝cDNA文库. 在营养缺陷型培养基上挑取三阳性克隆. 进行回转实验和免疫共沉淀验证.freelain与Daxx相互作用. 结论: TRAF3通过TRAF Domain与Daxx相互作用，可能参与了Daxx的调控和功能，为进一步了解Daxx作用的分子机制奠定了基础. 【关键词】 凋亡 0引言 死亡结构域相关蛋白（death domainassociated protein， Daxx）在核内作为转录调控子发挥促凋亡作用［1 ］；另一方面，在各种凋亡刺激下，Daxx可以从核转移到胞质中，介导肿瘤坏死因子受体(TNFR) 超家族成员促凋亡信号的转导. Daxx和FADD分别是Fas下游的两条截然不同的凋亡通路. Daxx通过活化JNK通路，不依赖于caspase,参与凋亡的活化［2］. 随着大量的研究，Daxx的促凋亡功能受到了挑战. 如Michaelson等［3］发现缺乏Daxx 基因的鼠胚胎发育受损,大量胚胎干细胞系出现凋亡,他提出Daxx基因是胚胎发育所必需的,直接或间接起着防止凋亡的作用. 由于Daxx在凋亡方面矛盾的功能，通过对Daxx和其他蛋白质之间相互作用的研究，来了解Daxx的调控和功能，具有非常重要的意义. 我们利用酵母双杂交技术，以Daxx为诱饵在成人肝cDNA文库中筛选相互作用蛋白，以期为进一步研究Daxx作用机制提供有用的线索. 1材料和方法 1.1材料酵母双杂交系统ProQuestTM T (CAT SERIES 10835)、成人肝cDNA文库ProQuestTM premade cDNA library (Human Liver)购于Invitrogen 公司. JM109感受态、HepG2细胞为本室保存. pCMVMyc是Clontech公司产品，pFLAGCMV2是Sigma公司产品. 各种生化试剂购于北京百灵克生物科技公司. 引物由北京赛百盛公司合成. 序列测定由北京奥科公司完成. 1.2方法 1.2.1pDBLeuDaxx载体的构建利用PCR在成人肝文库中扩增全长的Daxx开放阅读框，Daxx引物序列设计如下，P1: 5′GCG TCG ACC ATG GCC ACC GCT AAC AGC ATC3′; P2：5′TTG CGG CCG CTA ATC AG AGT CTG AGA GCA3′；PCR 反应的条件: 94℃预变性4 min; 94℃变性45 s, 64℃退火45 s, 72℃延伸2 min, 30个循环, 最后72℃延伸7 min. 将回收的PCR片段利用SalⅠ和Not I酶切，随后与同样酶切好的pDBLeu载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态,经卡那霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，提取转化子质粒进行PCR和酶切鉴定后测定DNA序列. 1.2.2诱饵质粒的转化和3AT的确定将所构建好的pDBLeuDaxx转化到酵母MaV203中，通过对3氨基1，2，4三唑（3Amino1,2,4Triazole，3AT）浓度梯度平板上的生长情况来确定抑制His基础表达的3AT水平，观察有无自激活作用. 1.2.3双杂交系统对成人肝CDNA文库的筛选和阳性克隆的鉴定用转化了Daxx的酵母制备感受态，然后转化成人肝CDNA文库质粒，通过对His,.freelan滤纸的YPAD平板上，液氮反复冻融，加入Z buffer/Xgal溶液，30℃， 观察24 h内菌落是否变蓝，以确定相互作用位点. 1.2.6TRAF3和Daxx相互作用位点的定量分析将TRAF3缺失体与Daxx共转的单克隆接种于2.5 mL SCLeuTrp培养液中，摇床过夜. 将1 ml过夜培养物部分接种于5 mL YPAD培养液中，使A600 nm约为0.5，30℃，摇床直到A600 nm为1.0~1.5. 将细胞培养物分装在1.5 mL EP管中，14 000 g离心30 s,小心去除上清. 每管细胞沉淀用100 μL Buffer 1 重悬，加入直径为0.5 mm的酸洗玻璃珠，使终体积为200 μL. 涡悬1~2 min. 准备空白对照，空白对照组成为100 μL Buffer 1和900 μL Buffer 2.