利用尿素酶试验测定结核分支杆菌耐药性的方法学研究论文.docVIP

　　利用尿素酶试验测定结核分支杆菌耐药性的方法学研究论文 武延隽 赵中夫 明 亮 刘明社 李水仙 薄红霞 【摘要】 目的：利用尿素酶试验的方法对结核分枝杆菌的耐药性进行检测。方法：采用液体结核分枝杆菌的培养基加尿素和酚红指示剂，高压消毒灭菌，将分离纯培养的结核分枝杆菌接种其中, 再加入不同浓度的抗结核分枝杆菌的药物培养，分别设阳性和阴性对照。待阴、阳性对照结果完全清晰时，终止培养，观测结果。结果：结核分枝杆菌、在500 cfu/mL以上时，结果在3 d～7 d内显现;在500条以内时,其结果在培养7 d～10 d内显现；阳性菌株中，通过加温处死.freelinate drug resistance of tubercle bacillus by employing urease test．Methods: The observed purified mycobacterium ycobacterium medium e apparent．Results: The results became apparent at 3 to 7 days ount of the incubated mycobacterium is more than 500 cfu/mL, and 7 to 10 days ount is less than 500 cfu/ml. To avoid the fake positive samples, the positive mycobacteriums ethod, urease test method had no statistic differences (χ２=2.25，P＞0.05)。Conclusion: Urease testing is a convenient and rapid method to inspect drug resistance of mycobacterium tuberculosis. Key tuberculosis；Urease；Drug resistance 尿素酶是一种胞外酶，多数细菌含有该酶，可分解尿素，使环境变碱，所以，常用尿素酶试验来进行细菌的鉴定。分枝杆菌多数菌种含有尿素酶，如结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、胃分枝杆菌均为阳性。而这些分枝杆菌是临床结核病的主要病原体。 尿素酶的存在是结核菌具有活性的标志之一，如果在培养中加入某种药，控制了该酶的产生，则说明某种药物对结核分枝杆菌有杀菌效果。否则尿素酶继续产生，利用该机制我们设计了结核分枝杆菌耐药性的尿素酶测定试验。现将我们的研究结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种：本室保存的耐药结核分枝杆菌菌株，临床标本常规处理后，分离培养鉴定结核分枝杆菌菌株。对照菌株购自中国生物药物鉴定所细菌室（菌株编号H37RV）。 1.1.2 培养基：绝对浓度法采用豆浸液改良罗氏培养基［１］；尿素酶法采用含尿素和酚红指示剂的结核分枝杆菌液体培养基（苏通氏培养基）。 1.1.3 抗痨药物：14种抗痨药物均购自上海医药集团有限责任公司信宜制药总厂，其中利福平(RFP)、 异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、 利福定 (RFD)、利福喷丁(RFPD)、吡嗪酰胺（PAZ）、立刻肺疾、卷曲霉素(CPM)、环丝氨酸(CS)取得该厂的纯品药物；而卡那霉素(KM) 、对氨柳酸（PAS）、丁胺卡那、奥复星、链霉素(SM) 使用该厂的注射用瓶装药，取得了该厂此批药物的药物效价，并严格按照结核病诊断细菌学检验规程中,抗结核药物溶液配制及稀释的方法进行计量的折算［１］。 1.2 方法 1.2.1 含尿素结核分枝杆菌培养基的制备：成分：天门冬酸4.0 g,枸橼酸2.0 g, k2HpO4 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g，0.1%酚红25 mL,枸橼酸铁铵0.05 g,甘油 60 mL,.freelL，尿素 12 g(0.12%)［１］，另外采用固体方法进行药敏试验时，培养基可选择改良罗氏培养基。其制备方法略有不同。 制备方法：将上述成分混合于蒸馏水中，加温溶解，调pH为6.8，过滤，分装三角烧瓶，每瓶装99 mL，121.3 ℃15 min，高压灭菌，4 ℃～8 ℃冰箱保存备用。 1.2.2 琼脂绝对浓度法培养基的制备与药物的浓度：绝对浓度法严格根按照中国防痨协会，结核病诊断细菌学检验规程的方法操作［1］。 1.2.3 试验菌液的配制：将试验菌接种于豆浸液结核分枝杆菌培养基培养20 d，待生长至培养基斜面的1/3以上时，刮取菌落，粘磨，并用硫酸钡比浊管比浊，用Teen-80生理盐水配成5×105/mL～5×106/mL菌悬液，采用10倍递次稀释，待用。 1.2.