杂交瘤细胞的培养,保存和复苏.docVIP

杂交瘤细胞培养冻存与复苏 杂交瘤细胞适用于无血清的培养基，无血清培养的基础培养基和添加物质杂交瘤细胞的无血清培养基通常是在标准的基础培养基中添加小分子和大分子物质，以代替血清的各种功能。不同基础培养基对细胞的无血清培养有一定的影响。不同细胞系对基础培养基也有选择性。最常用的基础培养基有RPMI 1640，F12，IMDM，DMEM+F12,DMEM+F12+RPMI 1640。形成的无血清培养基常能支持杂交瘤细胞在分批培养中生长到1×106细胞/ml以上，最终的单抗浓度可达10 μg/ml~100 μg/ml。基本上你说的那两种都有可能，你可以参考以下操作：【转贴】细胞融合和杂交瘤细胞培养用试剂的配制  RPMI-1640基础培养液，1 000ml RPMI-1640粉 10.4g 丙酮酸钠 0.11g 用900ml三蒸水(或无离子水再经过双蒸)，通CO2搅拌溶解。称取1.8g NaHCO3，用少量三蒸水溶解，边搅拌边加入1640液中。补足1 000ml，通过0.22μm滤膜正压过滤除菌 (用CO2钢瓶加压)，分装，置30，菌检48小时4存放。效期不超过三个月。  RPMI-1640完全培养液，100ml 双抗(青、链霉素) 0.1ml 3％L-谷氨酰胺 2.5ml 犊牛血清 15.0ml 1640基础培养液 81.5ml 用时现配，4下存放不超过一周，用于细胞融合和克隆化培养的全培养液，可将小牛血清增至20％。 200mmol/L(3％)L-谷氨酰胺溶液 L-谷氨酰胺 5.846g 三蒸水 200ml 加热至50使全溶，0.22μm膜滤除菌，按每管4ml分装，-20保存。 双抗溶液 青霉素(钠盐) 100万iu 链霉素(硫酸盐) 1g 溶于100ml灭菌三蒸水中，小量分装，-20冻存。杂交瘤细胞的保存 当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：1．材料(1) 细胞：取对数生长期的细胞。(2) 10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌）：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。(3) 20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。(4) 灭菌的2ml安瓶等2．操作方法(1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。(3) 1 000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×107细胞／ml。(3) 取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。(4) 用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。(5) 放4 2h。(6) 放液氮罐气态部分（-70）15h。(7) 转入液氮部分。杂交瘤细胞的复苏1．从液氮罐中取出安瓶立即放37水浴中速溶。2．无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。3．逐滴缓慢加入20％FCS－1640培养液3.5ml，这个过程延续3min。4．5％CO2饱和湿度，37培养。5．4h后弃去培养液上清，加入新鲜的20％FCS－1640培养液。6．继续培养，换液，以至形成单层。