临床基因诊断-培训课件.ppt

肿瘤的基因诊断 肿瘤的基因诊断目前主要集中在以下几个方面： 肿瘤转移标志物 肿瘤抗药基因 突变的癌基因 肿瘤相关的病毒基因 肿瘤基因的分子诊断意义 1.肿瘤的早期诊断和筛选 2.肿瘤疗效监测 3.肿瘤的预后判断 4.肿瘤微转移检测 美国前副总统汉弗莱Humphrey) 在1967年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞 良性“慢性增生性囊肿”，未进行手术治疗。 九年后，他被诊断为患有“膀胧癌”，两年后死于该病。 1994年，研究者用灵敏的PCR技术对上述汉弗莱1967年的病理切片进行了P53抑癌基因检查，发现那时的组织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其P53基因的第227个密码子已经发生了一个核苷酸的突变。就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出来了 P53抑癌基因 基因诊断 黄少军 市中心医院 PCR与基因诊断技术 基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。 Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶的作用，可在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍。 九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。 基因诊断 基因 蛋白质 性状 生化诊断 基因诊断 临床诊断 方法 优点 缺点 显微镜镜检 简单易行，可直接观察到寄生虫的形态 速度慢，灵敏度低，对经验水平要求高费时费工，无法辨别形态相近的寄生虫 体外培养、接种 能检测到活的寄生虫，并可检测感染性和感染程度 速度慢、花费高，寄生虫可能难以进行体外培养，且必须使用动物材料 抗体检测 简单、快速、能够实现自动化，可用于检测大量的样品 无法区分活的寄生虫与处在潜伏状态的寄生虫。有时会有非特异反应发生 DNA杂交及PCR 快速灵敏，能够实现自动化，可以分辨不同种的寄生虫，不需要以前有寄生虫感染病史 花费高，步骤多，无法区分活的和死的寄生虫，有时会有假阳性或假阴性 检测寄生虫感染的诊断方法的比较 基因诊断的特点 特异性高 检测目标是基因，为原始的致病因素 灵敏度高 待测标本往往微量，目的基因只需pg水平 稳定性高 基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需处于活性状态 诊断范围广，适应性强 确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态 临床应用前景好 基因诊断优点 从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制 显著提早产前诊断的时间 无需对组织、器官或细胞进行选择 快捷准确、安全 基因诊断常用的技术 核酸分子杂交 PCR（聚合酶链式反应） 限制性酶切分析 SSCP（单链构象多态性分析） DNA 测序 DNA 芯片技术 DNA Southern blot, FISH,PCR, Sequencing, micoarray, restriction analysis, RFLP，SSCP RNA Northern blot, RT-PCR, micoarrays Protein Western blot, Immuno-histochemistry, microarray 基因诊断的原理 利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA或RNA水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法 策略 检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因 检测与某种遗传标志连锁的的致病基因 检测表型克隆基因 感染性疾病的诊断 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 法医学鉴定 分子诊断的临床应用 一、感染性疾病的诊断 利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快速准确地检测出病原性物质。 疟疾的分子诊断： 检测是否存在疟原虫 抽取血样进行镜检 免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体 无法区分是以前感染还是现在感染 DNA杂交诊断 例一： PCR检测 针对疟原虫特有的一段188bp的DNA序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的条带 原位PCR(in situ PCR,ISPCR ) 在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测 不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位 二、遗传性疾病的诊断 羊水和胎盘绒毛膜检测 镰刀形细胞贫血症(sickle-cell anemia) 典型的单基因遗传性疾病 血红蛋白的β链（β珠蛋白）的第六个氨基酸Glu发生突变成Val 血红蛋白 ?-链上 谷氨酸变成缬氨