免疫标记技术,节酶免疫技术-培训课件.ppt

固相抗原 标本（含抗体） 底物 酶标抗体 E E E E E 竞争法检测HBcAb 2.竞争法检测HBeAb： 先将HBeAb包被在固相载体上，形成固相抗体，同时加入待测样本和中和抗原HBeAg，待测样本的抗体将与固相抗体竞争与中和抗原HBeAg结合。加入酶标的特异抗体，再加入酶底物，则显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比。 固相抗体 标本（含抗体） 抗原 酶标抗体 E E 底物 E 竞争法检测HBeAb (五) 捕获法 固相载体上连接的是IgM的第二抗体，先将标本中的IgM类抗体捕获，然后再分别加入特异抗原和酶标抗体（动物源性IgG），形成抗人IgM-IgM-特异抗原-酶标抗体的复合物，复合物含量与待测IgM成正相关。最后加入底物，依据显色程度来确定待测血清中IgM的含量。 固相抗人lgM抗体 E 标本（含抗体） 抗原 底物 E E 捕获法检测lgM抗体 在应用此法时需注意RF(IgM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(IgM类)既能与固相载体上的IgM第二抗体结合，又能与随后加入的酶标抗体结合，从而导致假阳性结果。 (六) 双抗原夹心法 将已知抗原包被在固相载体上，待测标本中的相应抗体可分别与固相抗原和酶标抗原结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原的复合物，加入底物后依据显色程度来确定待测抗体的含量。 E 固相抗原 标本（含抗体） 酶标抗原 底物 E E 三、ELISA的关键技术 （一）各种试剂的制备 1．抗原和抗体 2．包被与封闭 包被(coating)是将抗原或抗体固定在固相载体上的过程。 封闭(blocking)就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。 3．酶标结合物的制备 （二）最适工作浓度的选择 各类血清 抗原稀释度 1：50 1：100 1：200 1：400 1：800 强阳性 1.20 1.04 0.84 0.68 0.42 弱阳性 0.64 0.41 0.30 0.22 0.19 阴 性 0.23 0.13 0.08 0.06 0.05 稀释液 0..08 0.02 0.02 0.02 0. 04 间接法测抗体中包被抗原最适工作浓度的选择 （三）测定方法的标准化 1．加样 应力求准确，并注意不可产生气泡。 2．温育 注意反应的温度和时间应按规定的 要求，整块反应板的温度应一致。 3．洗涤 洗涤有手工洗涤和洗板机洗涤两种方法，若用洗板机洗涤要适当增加洗涤次数。 4．显色 要控制好显色时间。 四、评价与应用 评价 ELISA的方法具有高度的特异性和灵敏度，操作方便快速，试剂稳定，对环境无污染，仪器、设备要求简单，实验结果既可以用肉眼观察作定性分析，也可以用酶标仪进行定性、定量分析，已经成为临床免疫检验中的常用技术。 应用 1.病原微生物测定 2.激素测定 3.药物测定 4.肿瘤标志物 5.蛋白质测定 第三节 其他酶免疫技术 一、均相酶免疫技术 （一）酶扩大免疫分析技术 （二）克隆酶供体免疫分析 酶扩大免疫分析技术示意图 克隆酶供体免疫分析示意图 液相酶免疫技术是非均相酶免疫技术的方法类型之一，因抗原抗体反应在液相中进行而得名。其依据样品抗原加样顺序和温育反应时相不同可分为平衡法和非平衡法两种类型。 二、液相酶免疫技术 三、斑点酶免疫吸附试验 属于ELISA的一种类型，与前述的ELISA有所不同的是用吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜（NC膜）代替了聚苯乙烯反应板来作为固相载体，酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。 四、斑点酶免疫渗滤试验 是将NC膜封于塑料小盒中，先在塑料小盒NC膜中滴加已知抗体，干燥后封闭，再依次加入待测标本、酶标抗体，最后加入底物，阳性时可在膜上出现有色斑点。 五、免疫印迹试验 是一种将蛋白质电泳和酶免疫测定相结合的技术，综合了凝胶电泳的高分辨力和抗原抗体检测的高特异性和高敏感性，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。 （一）生物素和亲和素的特点 1．生物素(biotin，B) 六、 BAS-ELISA 2．亲和素(avidin，A) 3．链霉亲和素(streptavidin，SA) 常用的方法有三种： BA法 BAB法 ABC法 (二） BAS-ELISA 小 结 酶免疫技术 酶免疫组织化学技术 酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相 酶免疫测定 固相酶免疫测定 （最常用的为ELISA） 液相酶免疫测定 双抗体夹心法 双位点一步法 间接法 竞争法 捕获法 双抗原夹心法 酶扩大免疫测定技术 克隆酶供体免疫分析 人民卫生出版社 人民卫生出版社