去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损论文.docVIP

　　去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损论文 王德超 郑玉琴 孙建华 史晨辉 董金波 刘维钢 【摘要】 目的：研制理想的能够修复骨缺损的骨材料，为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。方法：体 外扩增诱导兔骨髓基质干细胞，将其与去细胞牛松质骨复合培养。造成兔桡骨中段 10 mm 骨缺损模型，分复合细胞组、单纯材料组、空白对照组。通过大体观察、放射学检查、组织学检查观察骨缺损的修复情况。结果：去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损，12 周时缺损区完全被新骨代替，骨髓腔完全通畅，优于单纯材料组的修复效果，单纯材料组优于空白对照组。结论：去细胞牛松质骨具有良好的成骨能力.freelaterial for the repair of bone defect, for the clinical use in the bone reconstruction field. Methods Rabbit marro cells (MSCs) ixed odel of bone defects, divided into 3 groups:named plex group, acellular bovine cancellous bone group, and blank control. The animals en inspection, X-ray examination and histological observation. Results At 12 ed plex group, and their marroed, ay be used as a kind of ideal scaffold material. 〔Key SCs）与去细胞牛松质骨载体相结合，构建组织工程骨，探索修复兔桡骨节段性骨缺损的可行性。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 材料与试剂 新鲜牛肱骨（石河子市农贸市场），脱细胞的各种试剂（曲拉通 X-100 由上海生物工程公司提供，氯化钠由西安化学试剂厂提供）， Hassion 染色试剂盒（广州市俪科贸易有限公司），新西兰大白兔（石河子大学实验动物中心），胰酶（华美），地塞米松（Sigma），维生素 C（Sigma），β- 甘油磷酸钠（Sigma），低糖 DMEM 培养基（GIBCO 公司），新生牛血清（Hyclone，美国），小牛白蛋白血清（Sigma），60Co 辐射源（加拿大），倒置荧光显微镜（Olympus），电镜（LEO-1430VP，德国）。 1.1.2 牛松质骨标本的准备 取新鲜牛肱骨 1/3 段，制成 1.5 cm×0.5 cm ×0.5 cm 大小，50℃自来水反复冲洗 3 次后，蒸馏水冲洗 3 次，置于 PBS 保存液中，在适宜的温度、pH 值条件下，采用 10% 高渗生理盐水和去污剂 TritonX-100 对牛肱骨进行组织工程学的去细胞处理。包装后 60Co 照射（20 kGy）备用。 1.2 方法 1.2.1 骨髓基质干细胞的分离、培养、诱导鉴定 1 月龄新西兰大白兔，3% 戊巴比妥钠腹腔麻醉，无菌条件下取双侧股骨，用含有肝素的 PBS 缓冲溶液冲洗骨髓腔，冲洗液 5 mL 缓慢加到已加入了5 mL 淋巴细胞分离液的 10 mL 离心管中，2 000 r/min，离心 30 min，用吹打管轻轻取其界面云雾层液面，PBS 漂洗，1 500 r/min 离心 5 min，弃上清，加入基础培养液 DMEM 10 mL，制成单细胞悬液，3×106/mL 接种于 75 mL 培养瓶内，加 5 mL 20% 胎牛血清的低糖 DMEM 培养基，置于 5% C O2、37℃ 饱和湿度的 CO2 孵箱中进行培养，72 h 后全量换液。以后每隔 72 h 换液 1 次。待贴壁细胞融合达 80%~90% 后，0.25% 胰蛋白酶 37℃ 下消化，进行传代、扩增培养。收集第 3 代 BMSCs，以 2×104/mL 的密度培养于诱导培养液（含 20% 新生牛血清，10-8 mol/L 地塞米松，50 L/mL 维生素 C，10 mmol/L β- 甘油磷酸钠）。同时以同样密度细胞培养于 20% 新生牛血清低糖 DMEM（L-DMEM）培养液为对照。在第21 天分别取出贴壁生长有细胞的盖玻片，使用 75% 乙醇固定液固定 30 min。三蒸水冲洗，用 5% 的硝酸银染色，避光，室温孵育 30 min。再以三蒸水冲洗，在紫外灯下照射 30 min。以 1% 中性红溶液染色 30 s。 1.2.2 BMSCs 细胞与 ABCB 复合培养 收集第3 代 BMSCs，加入含成骨细胞诱导液的条件培养基培养 3 d，制成 5×106/mL 浓度的细胞悬液进行接种，每孔 2