受体介导的cmyc反义核酸抑制肝癌Bel7402细胞增殖的机制论文.docVIP

　　受体介导的cmyc反义核酸抑制肝癌Bel7402细胞增殖的机制论文 【摘要】 目的 探讨半乳糖受体介导的cmyc反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)抑制肝癌Bel7402细胞增殖的机制。 方法 cmyc ASODN与半乳糖(galactose,Gal)聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)相作用形成GalPEIASODN复合物，作用于人肝癌Bel7402细胞，通过流式细胞仪检测细胞周期、AnnexinVFITC 和碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）双染色、DNA电泳实验观察GalPEIASODN对Bel7402细胞的作用。结果 采用流式细胞仪检测细胞周期，细胞对照组、GalPEI对照组、ASODN对照组，细胞增殖指数分别为35.04%、33.95%、32.90%，GalPEIASODN组细胞增殖指数为23.65%，与细胞对照组相比.freelyc反义核酸通过阻止细胞从G0/G1 期细胞向S 期的转变，诱导细胞坏死，达到抑制细胞Bel7402增殖的作用。 【关键词】 cmyc 反义核酸 肝癌 细胞坏死 细胞周期 Mechanism of cmyc Antisense Oligodeoxynucleotide Mediated by Receptor on the Proliferative Inhibition of Bel7402 Cells Key yc; Antisense oligodeoxynucleotide; Hepatocellular carcinoma; Necrosis; Apoptosis cmyc 基因是人们发现较早的一种原癌基因，cmyc蛋白是一种具有DNA结合功能的转录因子，启动细胞增殖，抑制细胞分化，参与细胞凋亡。人类许多肿瘤可检测到cmyc基因的异常表达，如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、头颈部肿瘤、食管癌、胃癌、结肠癌等。在正常肝组织，cmyc基因低表达或不表达，在原发性肝癌的癌组织及癌周组织中，cmyc蛋白表达水平显著性升高；cmyc蛋白表达与肝癌的发生、发展密切相关，而且与肝癌的分期、预后有关1,2。cmyc 反义核酸能抑制人肝癌细胞生长3。 单纯反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)导入细胞的效率不高，而受体介导的反义核酸投递系统则具有高效、靶向的特点4。肝细胞表面具有脱唾液酸糖蛋白受体等5种专一性受体，能识别末端带有半乳糖残基的糖蛋白或人工合成的配体并与之结合，这种配体－受体的结合是非常高效的。前期实验采用半乳糖(Galactose,Gal)聚乙烯亚胺（polyethyleneimine,PEI）交联载体与cmyc ASODN形成GalPEIASODN复合物，构成以肝细胞膜半乳糖受体为靶向的反义核酸投递系统，作用于人肝癌Bel7402细胞，证明半乳糖受体介导的cmyc反义核酸对人肝癌Bel7402细胞具有靶向投递作用并能高效抑制该细胞的增殖5，本实验旨在探讨cmyc反义核酸抑制Bel7402细胞增殖的作用机制。 1材料与方法 1.1主要试剂及仪器 半乳糖－聚乙烯亚胺(GalPEI) 转染试剂（法国Polyplus Transfection公司）。cmyc 反义核酸的合成：针对cmyc 基因核苷酸序列162～179设计反义寡脱氧核苷酸并进行全程硫代修饰，上海生物工程公司合成，设计序列如下：5′CTT CTC GAG GCA GGA GGG 3′，AnnexinVFITC /碘化丙锭（Propidium Iodide，PI） 细胞凋亡检测试剂盒（美国Bender Medsystems公司和北京宝塞生物技术公司）。CO2培养箱(德国Heraeus公司)，流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)，Quantimet 970凝胶图像分析仪（英国剑桥仪器公司）。 1.2细胞培养 Bel7402肝癌细胞由中山大学北校区生化教研室惠赠。细胞培养体系：RPMI1640培养液，含10%灭活小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，置37℃、5 % CO2培养箱中培养，隔3d传代，Bel7402细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。实验选用对数生长期、台盼兰拒染率 95%的Bel7402细胞。 1.3GalPEIASODN复合物的制备 cmyc ASODN用不含血清的RPMI1640液溶解，配150μmol/L溶液备用。 实验前用不含血清的RPMI1640液分别溶解GalPEI转染试剂和cmyc ASODN，混匀，