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第34章 DNA的复制和修复 遗传信息传递的 中心法则 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。 目 录 一 DNA的半保留复制 DNA半保留复制概念 1、DNA半保留复制实验依据 复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验) DNA的半不连续复制 子代DNA中的一条链的合成是连续的，另一条链的合成是不连续的，DNA的这种复制方式称为半不连续复制。 1968年，冈崎的著名实验观察到DNA复制过程中，有一些不连续片段，称为冈崎片段。 原核生物中冈崎片段约含1000—2000个核苷酸，真核生物约为400个核苷酸. 新DNA的一条链是按5’- 3’方向（与复制叉移动的方向一致）连续合成，称为“前导链”；另一条链的合成是不连续的，即先按5’ - 3’方向（与复制叉移动的方向相反）合成冈崎片段，再连接成一条完整的链，称为滞后链。 冈崎片段与半不连续复制 2 原核生物DNA聚合反应有关的酶类 (5）单链结合蛋白(single-strand binding protein,SSB)：结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。 (6）拓扑异构酶(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。 DNA聚合酶 模板：单链DNA 引物：RNA 底物：dNTP 辅助因子：Mg2＋ 合成DNA的方向：5’ - 3’方向延伸 DNA连接酶 可将DNA中单链缺口上相邻的两个核苷酸， 以磷酸二酯键连接起来。 DNA连接酶有两种:一种以ATP为能量来源的动物细胞和某些噬菌体连接酶--T4连接酶，另一种以NAD+为能量来源的大肠杆菌DNA连接酶。 DNA 连接酶（ligase）的作用 连接酶反应的具体机理 解螺旋酶 解链酶（或称解螺旋酶）: 此酶通过水解ATP以获得能量去松开双股DNA，每解开一对核苷酸需水解2分子ATP。解链酶对单链DNA的亲和力强，而对双链DNA或RNA的亲和力弱，复制时DNA解链酶可以沿着滞后链模板的5’—3’方向随着复制叉的前进而移动，以解开双链。 拓朴异构酶 拓朴异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ )：原核生物中曾称为ω—蛋白。真核生物中曾用过多种名称，如转轴酶、松旋酶、松弛酶和切豁封闭酶等。其作用是使双链DNA中的一股切断，使链的末端沿着螺旋轴按双螺旋反方向旋转，超螺旋消除后再将切口封闭，使DNA变为松弛状态。即松弛或消除负超螺旋,催化反应不需ATP。 拓朴异构酶 拓朴异构酶Ⅱ(Topo Ⅱ )：又称DNA旋转酶。广泛存在于各种生物中。 作用是在水解ATP的同时能迅速使DNA链断开又接上，而使松弛态的DNA转变为超螺旋状态，引入负超螺旋,在没有ATP时，它又可使负超螺旋DNA变为松弛态。 单链DNA结合蛋白 单链DNA结合蛋白（SSB）: 它与单链DNA结合，从而防止两条链重新形成双螺旋，结合后还能保护单链DNA不被核酸酶水解。因此，SSB在复制中维持模板处于单链状态并能抵抗核酸酶水解保持单链的完整。 RNA引物和引物酶 RNA引物和引物酶: 任何一种DNA聚合酶都不能催化复制的起始。都需要一个引物。多数情况下是以RNA片段为引物，由引物酶催化合成。引物酶是一种不同于催化转录过程的RNA聚合酶。引物酶通常需要和几种蛋白质因子结合形成引发体才能发挥作用。例如大肠杆菌的dna蛋白能协助引物酶识别起始位点，并与起始部位结合。 RNA引物的长度是不同的，在动物细胞中引物长度约10个核苷酸，第一个核苷酸常用ATP。细菌的引物为50—100个核苷酸，但也有仅2—4个核苷酸的。 大肠杆菌三种DNA聚合酶比较 （1）DNA聚合酶 I 103 kDa的单链多肽，可以被蛋白酶切成两段，C端的2/3包括聚合酶活性位点；N端的1/3包含核酸外切酶校正活性（一次可切除1-10个碱基）。 （2） 利用DNA聚合酶 I 进行缺口平移法制备探针的基本原理 DNA聚合酶的3′- 5′外切酶水解位点 主要功能是从3′→5′方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸，这种功能称为校对功能，这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的. 因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的 . DNA聚合酶5′- 3′外切酶活力 酶活性是从DNA链的5′端向3′末端水解已配对的核苷酸，本质是切