力学因素对脂肪干细胞分化的平滑肌细胞表型转化的影响-FDUROP.doc

力学因素对脂肪干细胞分化的平滑肌细胞表型转化的影响 上海医学院 王畅 指导老师 潘銮凤 摘要：近年来干细胞研究的重大进展，利用血管组织工程方法构建良好血管替代物已成为极具临床应用前景的研究重点。种子细胞的获取、培养是组织工程血管研究的关键环节。而血管平滑肌细胞的两种表型在力学因素影响下的相互转化对于具有临床应用价值的组织工程血管的构建具有重要意义。本课题拟在上述背景下，将脂肪干细胞分化为混合型的平滑肌细胞，并研究不同的压力和剪切应力联合作用对于混合型平滑肌细胞表型转化的影响，为构建与天然血管接近的组织工程血管提供指导。 关键词：脂肪干细胞，平滑肌细胞表型，压力，剪切力 引言（前言） 近年来，动脉粥样硬化、动脉瘤、先天性血管畸形以及外伤性血管损伤等造成的心血管损伤发病率逐年增加，已成为临床死亡的主要原因之一。随着自体血管移植技术的发展，尤其是人工合成血管制备技术的不断提升，使临床修复直径大于5mm血管的成功率大大提高。 来源于自体静脉的内皮细胞与血管平滑肌细胞在体外培养中扩增能力不足，容易老化；扩增后血管内皮细胞抗血小板聚集能力减弱，易形成血栓，均不适宜作为血管组织工程的种子细胞来源。干细胞研究为血管组织工程种子细胞的解决开辟了新的途径，目前已有应用骨髓来源的内皮祖细胞、间充质干细胞分别诱导的内皮细胞与平滑肌细胞构建组织工程血管的报道。但是，由于骨髓基质干细胞在骨髓中含量极低（每105贴壁细胞中仅含一个干细胞），需体外扩增较长时间（1-2个月）才能达到构建的细胞数量；同时由于存在着分离过程复杂、细胞扩增与分化随机体状况（如年龄、疾病等）不同而波动较大、骨髓抽取过程病人较痛苦等问题，使骨髓来源的干细胞在应用中存在较大的局限性。 近年研究发现，脂肪基质中存在着一类具有多向分化潜能的成体间质干细胞——脂肪干细胞（Adipose Derived Stem Cells, ADSCs），ADSC能够在体外向成骨、成软骨、成脂肪、成肌等多个方向分化。脂肪干细胞体内分布广，分离培养操作简单，较BMSCs具有更强的扩增能力且无明显的对血清批号的依赖性，因此ADSCs具有更为重要的临床应用价值。脂肪抽吸术后丢弃的脂肪组织含有数量充足的ADSCs（2-6×108有核细胞/300ml抽吸物），为ADSCs的应用提供了充足的来源。 血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMC）分泌细胞外间质构成血管中膜，也是执行血管收缩功能的重要功能细胞。研究证明体外培养的脂肪干细胞可特异性表达VSMC细胞骨架与细胞外基质的标志性蛋白。在PDGF-BB与TGF-β1联合诱导的条件下，ADSCs具有向血管平滑肌细胞分化的能力（专利申请号：200610026478.1）。上述研究表明，脂肪组织可作为平滑肌细胞种子细胞的干细胞来源，构建组织工程化血管。 血管壁从管腔面向外依次为内膜、中膜和外膜。平滑肌细胞作为主要的中膜细胞，是组织工程血管中发挥收缩血管、分泌蛋白、参与合成细胞外基质等功能的种子细胞。在机体的不同发育阶段，生理或病理状态下的机体，平滑肌细胞在结构上主要呈现两种形态：（1）血管的胚胎发育阶段或高血压、动脉粥样硬化等心血管病变部位中的平滑肌细胞增殖活跃，可合成大量细胞外基质，而缺乏肌纤维，称为合成型；（2）成年机体中的平滑肌细胞主要功能是通过收缩来调节血管张力，细胞内含有丰富的肌纤维，称为收缩型；在这两种表型之间存在不同程度的过渡形式。 自体外培养血管平滑肌细胞方法建立以来，细胞的培养大多置于静态培养液中培养。各种生化成分的微环境可以人工制造，但体外静态培养的细胞与体内细胞所处的力学环境相差甚远。其中尤以压力与剪切力为甚。因此体外培养的平滑肌细胞同体内的细胞在生物特性上有着很大的区别。研究表明，适宜的力学刺激可使培养血管具有类似正常血管的弹性、张力与生理功能。而且，发育生物学表明，力学刺激在心血管系统尤其是血管内皮与平滑肌细胞的成熟过程中发挥着重要作用。同时，不同的力学因素对平滑肌细胞表型的分化具有重要的影响。有研究表明，生理条件下的压力可以使平滑肌细胞向收缩型分化，过高或过低的压力使其向合成型分化。同时在接近生理条件的剪切应力下，平滑肌细胞有从合成型向收缩型转变的趋势。而在生理条件下，血管平滑肌细胞同时受压力和剪切应力两种力的作用，两种力共同影响平滑肌细胞表型的分化。 本研究中，我们将探索压力和剪切应力共同作用对脂肪干细胞分化的血管平滑肌细胞表型转化的影响，为构建与天然血管接近的组织工程血管提供指导。 1脂肪干细胞向平滑肌细胞诱导 1.1实验材料 3周龄雄性SD大鼠，DMEM培养液（含DMEM基础培养液，10%FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素）I型胶原酶（0.075%）无菌低渗氯化铵红细胞裂解液（10X液含