假单胞菌属的鉴定.docxVIP

成都市第二人民医院检验科 细菌SOP 文件编号：CDEY-LAB-XJ-CZ34 版本/修订号：B/0 主题内容 假单胞菌属的鉴定 生效日期 第 PAGE 550 页 共 NUMPAGES 1167 页 Laboratory of Chengdu No.2 People’s Hospital 假单胞菌属的鉴定 1、标本要求： 1.1 尽量用药前采集标本。 1.2 痰液：病人清晨咳痰于无菌、防漏小塑料盒内，切勿唾液送检。 1.3 尿液：病人留取12h尿液，送检。 1.4 粪便：病人留取粪便5?10g，送检。 1.5 脑脊液及其它无菌体液：用无菌瓶直接送检。血标本不要冷冻。 1.6 不可接受的标本：干的拭子、蜡盒、未消毒容器、留取24h后的尿或痰、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。 2、仪器 35℃孵箱、普通光学显微镜 3、试剂 羊血平皿、巧克力平皿、麦康凯平皿、1％盐酸四甲基对苯二胺水溶液、氧化发酵(O-F)培养管、硝酸盐培养管、氨基酸脱羧培养管、尿素培养管、糖醇发酵管、湖南长沙天地人非发酵菌鉴定板。 4、试验方法及原理： 4.1 氧化酶 用法：将滤纸片在1％盐酸四甲基对苯二胺水溶液中浸泡约1min，印刮平板上的菌落。 结果观察：10s内观察颜色变化，变红－紫黑色为阳性，不变为阴性。 4.2 Hugh-Leifson氧化发酵(O-F)培养管 用法：用针挑取可疑菌落穿刺接种于O-F培养管中，35℃培养过夜。 结果观察：高层上半部分变黄，为氧化型产酸；整个培养管变黄，为发酵型产酸；不变或变蓝为阴性。 4.3 硝酸盐还原试验： 方法：将待检菌接种硝酸盐培养管中，孵育过夜，加入等量A、B液1～3滴，观察结果。 结果：红色为“+”，即还原硝酸盐。 注意点： （1）．培养基不应含亚硝酸盐，以避免假阳性。 （2）．某些细菌还原硝酸盐的能力很强，还原硝酸盐为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解为氨、氮、氧化氮，造成假阴性。所以，观察结果时，如无红色出现，应加少量锌粉，仍无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐反应为阳性。若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检菌无还原硝酸盐的能力，即硝酸盐还原试验阴性。 4.4 尿酶试验 方法：将待检菌穿刺接种于尿素培养管中，孵育过夜，观察结果。 结果：培养管变红为尿素阳性，不变色为阴性。 4.5 氨基酸脱羧试验 方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养管和对照管中，封石腊油，35℃培养过夜，观察结果。 结果：培养管变紫色为阳性，黄色为阴性。对照管应保持黄色。 注意点： （1）．培养管的pH值很重要。 （2）．加封石腊油造成厌氧环境。因为在厌氧情况下氨基酸脱羧生成的胺才稳定。 （3）．对照管如不呈黄色，则氨基酸脱羧酶试验不能作出判定。 4.6 糖、醇发酵试验 方法：接种待检菌于糖醇发酵管，35℃孵育过夜，观察。 结果：培养管变红色为阳性，不变色或黄色为阴性。 5、常规鉴定过程： 5.1形态与染色：革兰阴性、直或微弯、较细长、散在排列、无芽孢、有荚膜、除鼻疽伯克霍尔德菌外，其他菌均有端鞭毛或丛鞭毛。 5.2培养特性：专性需氧，生长温度范围广，最适生长温度为35℃，少数菌种能在4℃或42℃生长。营养要求不高，普通培养基上均能生长。生长过程中可产生各种水溶性色素：绿脓素、脓玉红素、绿脓菌荧光素及脓褐素。 5.3 生化反应及鉴定要点：非发酵菌指一大群不利用葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖，需氧或者兼性厌氧，无芽胞的革兰阴性菌。主要包括假单胞菌属，产碱杆菌属，无色杆菌属，不动杆菌属，莫拉菌属，黄杆菌属等。与其他阴性杆菌的鉴别具体参见《埃希菌属的鉴定》。 5.3.1 属间鉴定：见下表1 表1：非发酵革兰阴性菌的初步分属 试验 菌属 假单胞菌属 无色杆菌属 黄杆菌属 不动杆菌属 产碱杆菌属 丛毛菌属 摩拉菌属 氧化酶试验 + + +/- - + + +/- 葡萄糖发酵试验（O/F） 0/- 0 0 0/- - - - 动力 +/- +/- +/- - + + - + 90%以上阳性；- 10％以下阳性；+/-约70％阳性； 0 为氧化 5.3.2 属内鉴定：假单胞菌属是根据1984版伯杰分类手册第一卷，医学与工业常见革兰菌进行分类。按rRNA同源性分为5群及未确定rRNA同源群有关的种。各种单胞菌的鉴别请见下表2： 6、药敏试验： 6.1挑取单个麦康凯平板上单个菌落(革兰染色阴性杆菌,氧化酶阳性),配成0.5麦氏单位药敏液,滴加于天地人非发酵菌药敏板中进行药敏试验,结果通过天地人药敏软件判读。具体可参 看天地人药敏板半自动操作规程。 6.2 嗜麦芽窄食单胞菌对亚胺培南天然耐药，所以临床不应选用；现在铜绿假单胞菌多重耐药正逐年上升，其耐药机制