毒理学重点.doc

毒理学上半部分总结 目前还存在以下几点需要补充和细化的地方： ⑴代谢活化的两相 ⑵癌基因的分类，具体机制 ⑶细胞恶性转化后的特点 第十六章 药物致突变作用的研究及其试验方法 Ames试验 原理 组氨酸缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨酸的培养基上不能生长，但在加有致突变原的培养基上培养，可产生回复突变，恢复合成组氨酸的能力成为野生型，能在缺乏组氨酸的的培养基上生长成为菌落，通过计数菌落出现的数目就可以估算药物诱变性的强弱。 正向突变 鼠伤寒沙门菌组氨酸+ 鼠伤寒沙门菌组氨酸- （野生型） 回复突变 （突变型、营养缺陷型） S9混合液 受试物 常用试验菌株 菌株名称 突变基因 附加突变 突变类型 修复 LPS R因子 TA97、TA98 hisD △uvrB rfa PKM101 移码突变 TA100 hisG △uvrB rfa PKM101 碱基取代 TA102 hisG △uvrB rfa PKM101 移码突变、碱基取代 注：hisD,组氨酸脱氢酶的结构基因；hisG，磷酸核糖ATP合成酶的基因，TA100和TA98可推荐用于大多数致突变物和致癌物的检测 （三）计量设计 西药＜＝5mg/皿，中药可超过5mg/皿，最低剂量1ug/皿或0.1ug/皿，至少五种不同剂量（药物不溶于水可用DMSO或乙醇作溶剂） （四）对照组 用溶媒作阴性对照；已知致突变作阳性对照；使用间接诱变物作对照时，注意平行设加S9与不加S9的对照。 （五）代谢活化：S9（经诱导剂处理过的肝脏微粒体酶） （六）试验方法：渗入法；点试法 （七）结果判断 1、渗入法：当药物浓度达到5mg/皿仍为阴性者，可以认为是阴性。 2、点试法：凡在滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落，该药物即为致突变物质，如只在平皿上出现少数散在的自发回变菌落，则为阴性。 哺乳动物培养细胞染色体畸变试验（对象，选材，剂量，实验设计（理解），结果判定，公式（考试不给） ） 动物 细胞：中国仓鼠肺细胞（CHL） 剂量：至少三种不同剂量，高剂量以50%细胞生长抑制浓度，但最高不要超过10mmol/L，中低剂量采用倍量稀释法。 代谢活化：S9（哺乳动物肝微粒体酶）进行体外代谢活化。 药物作用时间：非活化组分别作用24和28小时收获细胞，活化组作用6小时以上。 标本制作时间：分别在24和48h收获细胞制作标本，活化组可省略48h时间点。 对照：空白对照、阳性对照、溶剂对照和S9对照。 镜检：每种浓度至少观察100个中期分裂相细胞的染色体结构。 结果判定 染色体畸变率（%）= 染色体畸变总数/分析染色体的总数＊100% 细胞畸变率（%）=有染色体畸变的细胞数/分析染色体的细胞总数＊100% 畸变率5%为阴性（-）；畸变率＞5%为可疑（+）；畸变率＞10%为弱阳性（++）；畸变率＞20%为中度阳性；畸变率＞50%为强阳性；若某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的增加也为阳性。 人体外周血淋巴细胞染色体畸变试验 剂量：同动物 对照：溶媒作阴性对照，已知染色体断裂剂作阳性对照。 外周血的采集与培养，静脉2-3ml，加抗凝剂，培养加肝微粒体酶，药物处理24h或48h终止培养前加秋水仙素获得更多中期细胞 培养细胞的处理，离心，固定 标本制作 染色，Giemsa染色20min 镜检 结果判定 三、啮齿动物微核试验（实验过程，剂量选择，步骤，镜检，如何分辨细胞） （一）原理 骨髓细胞经致突变作用，染色体可发生畸变以致断裂，其断裂的碎片在分裂间期留在子代细胞内形成规则的一个或几个圆形或椭圆形结构的小块物质，由于它比普通细胞核要小，称之微核。但骨髓细胞中缺乏代谢活化酶系，对间接诱变物反应较差。有核细胞胞浆少，正常核叶极难与微粒相辨认，在无核的红细胞中才易于辨认。微核检出率与染色体畸变率之间有明显相关性。 （二）剂量：至少三种剂量，最高剂量以1/2LD50为基准，低剂量结合药效学及临床拟用剂量，再按一定比例插入中间剂量。 （三）实验过程 NIH小鼠，每组10只性成熟动物（雌雄各半）或至少6只性成熟雄性动物 1、给药：一组