不同类型的DNA聚合酶β基因对CHO细胞的影响论文.docVIP

　　不同类型的DNA聚合酶β基因对CHO细胞的影响论文 赵继敏，金戈，黄幼田，杨洪艳，郑智敏，董子明 【关键词】 流式细胞术 Effect of utant DNA polymerase β expression on CHO cells groerase β (DNA polβ) of utant（58 bp deletion） on Chinese hamster ovary cells (CHO). METHODS: The expression of mRNA of utant in transfectant cells ined by RTPCR and the groetry. RESULTS: Cell lines stably expressing utational polβ utant gene e on groutant have different effect on CHO cells. 【Keyetry 【摘要】 目的：比较野生型和突变型（58 bp缺失）DNA聚合酶β(polβ)基因对真核细胞生长特性的影响. 方法：将表达人野生型和缺失型DNA polβ的中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），用RTPCR方法鉴定野生型和缺失型DNA polβ mRNA水平的表达，MTT法测生长曲线、流式细胞术测细胞周期. 结果：转染野生型和突变型DNA polβ的CHO细胞株中.freelRNA水平的表达; 转染突变型（58 bp缺失）polβ基因的细胞增殖速度和S期比例增高均高于未转染组细胞，差异有统计学意义(P 0.05). 而转染野生型polβ基因对细胞增殖速度和细胞周期无明显影响（P 0.05）. 结论：高表达外源性野生型和突变型DNA polβ，对CHO细胞生长具有不同的影响. 【关键词】 DNA polβ; 转染; CHO细胞; RTPCR; 流式细胞术 0引言 碱基切除修复（base excision repaire, BER）是清除细胞内DNA损伤的主要途径，DNA聚合酶β（DNA polymerase β，DNA polβ）是BER过程中的关键酶. 研究polβ基因的突变及功能异常在肿瘤发生发展中的作用，对进一步阐明肿瘤的分子发病机制,对肿瘤的基因治疗有重要意义. 我们将不同类型的polβ的真核表达载体转染哺乳动物细胞，观察野生型和突变型polβ基因的表达对细胞生物学特性的影响如下. 1材料和方法 1.1材料 中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO)由陈萍萍博士惠赠, DMEM培养基为Hyclone公司产品, Trizol总RNA提取试剂盒为Gibco公司产品. CHO细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基、50 mL/L CO2, 37℃, 饱和湿润空气中培养. 1.2方法 1.2.1表达产物的mRNA水平的鉴定按Trizol试剂盒操作说明，分别提取野生型和突变型polβ转染和空载体转染的CHO细胞及未转染CHO细胞总RNA. 紫外分光光度计测定其浓度. 逆转录反应体系总体积为30 μL,反应体系中含1 mmol/L dNTP, 2.5 μmol/L随机引物，166.7 nkat RNA酶抑制剂，250.05 nkat AMV逆转录酶，1×逆转录反应缓冲液积5 mmol/L MgCl2,取总RNA 2 μg. 逆转录反应条件为42℃ 60 min,95℃变性5 min. 当鉴定目的基因在mRNA水平的表达时，RTPCR中我们采用了特异性较强的引物，利用质粒中T7启动子为特异性的上游引物序列，polβ特异引物为下游引物序列，来证实转染细胞中外源基因的存在. 上游引物为5′TAATACGACTCACTATAGGGAGA3′，下游引物为5′ ACTCGTATCATCCTGCCGAA3′，野生型和突变型polβ扩增片断大小分别为312 bp和254 bp,而未转染CHO细胞及转染空质粒细胞无相应片断. PCR反应总体积为30 μL,.freelmol/L MgCl2,10×PCR缓冲液3 μL,200 μmol/L dNTP,上下游引物各0.25 μmol/L,Taq酶8.335U,逆转录产物5 μL. PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性50 s，54℃退火50 s，72℃延伸50 s，30个循环后，72℃延伸7 min. 取两种转染细胞和转染空载体及未转染CHO细胞的RTPCR产物各5 μL，与上样缓冲液混合后进行15 g/L琼脂糖电泳. 1.2.2检测CHO的生长曲线和细胞周期取野生型polβ转染组对数生长期（CHOPTT 20 μL/孔，继续培养4 h. 小心吸除孔中的培养液，加入酸化异丙醇200 μL/孔