孤啡肽诱导白血病细胞K562凋亡论文.docVIP

　　孤啡肽诱导白血病细胞K562凋亡论文 郭鸿 赵丽 张宝红 李娟 陈轩 【摘要】 本研究探讨孤啡肽对白血病细胞K562增殖的影响及诱导凋亡的作用，采用MTT（四唑氮蓝）法检测不同浓度的孤啡肽对K562细胞生长的影响，应用瑞氏染色、电子显微镜观察药物作用后K562细胞形态的改变，流式细胞术检测孤啡肽对K562细胞细胞凋亡作用，DNA琼脂糖凝胶电泳观察孤啡肽作用后K562细胞内DNA的损伤程度。结果表明： 10-6-10-13 mol/L孤啡肽明显抑制K562细胞的生长，且存在时间依赖性，而剂量依赖性不明显； 10-6-10-7、10-9、10-12 mol/L孤啡肽作用72小时后显示明显的细胞毒作用。与对照组相比，10-9 mol/L孤啡肽作用72小时后K562细胞出现典型凋亡特征；流式细胞术检测发现： 0、10-7、10-8、10-9 mol/L孤啡肽作用72小时后出现凋亡峰.freeleasured by MTT assay. Morphological assessment of apoptosis ed ission electron microscope. The apoptosis peak easured by floetry. DNA fragmentation e-dependently and no-dose-dependently inhibited the proliferation of K562 cells at concentrations of 10-6-10-13 mol/L. Discrete maximum of cytolytic activity ol/L. pared ol/L for 72 hours shoission electron microscope. Apoptosis peak ol/L of OFQ for 72 hours, apoptosis rates entation (DNA ladder). It is concluded that OFQ can inhibit the proliferation of K562 cells and induce the apoptosis in K562 cells. Key ia; apoptosis; K562 cell 内源性阿片肽是在哺乳动物脑内天然形成的具有阿片样活性的物质。以前，阿片及其受体的研究一直是分子神经药理学和神经生物学研究的热点，如其代表吗啡已广泛用于术后镇痛。但是近年来大量的研究证明，阿片肽参与神经系统、内分泌系统及免疫系统的调节，并具有抗肿瘤和诱导细胞凋亡的作用［1］。曾有吗啡、脑啡肽［2］、埃托啡［3］、内吗啡肽［4］诱导细胞凋亡的报道，孤啡肽也是内源性阿片肽家族的成员，但尚未见相关报道。本实验采用K562细胞为靶细胞，研究孤啡肽对K562细胞增殖的影响，探讨孤啡肽作为白血病治疗药物的可能性和作用机制。 材料和方法 材料 白血病细胞系K562为兰州大学第一医院中心实验室保存的细胞系。孤啡肽由兰州大学生命科学院合成、表征和纯化，纯度 99 ％，相对分子量为1 809。RPMI 1640培养液为Gibco公司产品，新生牛血清为杭州四季清生物有限公司产品。 细胞培养 人白血病细胞K562细胞为悬浮生长的细胞，用含10 ％小牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、5 ％ CO2、饱和湿度条件下常规培养。 药物对细胞生长影响的四唑氮盐（MTT）比色法观察 取对数生长期的K562细胞，以2×105/ml的密度接种于96孔板中，设10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13 mol/L孤啡肽作用组，每个浓度设4个复孔，同时设阴性对照。作用终止前4小时加入MTT溶液（浓度为5 μg/ml），培养4小时后离心吸去上清，加入100 μl的DMSO，37℃培养10分钟，待结晶完全溶解后，用酶标仪于490 nm处测量吸光度A值，计算孤啡肽对K562细胞增殖的抑制率（inhibition rate， IR）。IR=［(Acontrol-Asample)/Acontrol］×100 % 细胞形态学观察 收集经10-9 mol/L孤啡肽处理72小时的K562细胞和对照组K562细胞后，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次，一部分细胞涂片，常规瑞氏染色；另一部分用0.25 %的戊二醛固定24小时，1 ％四氧化二锇固定2小时，用0.1 mol/L PBS洗2次，梯度丙酮脱水，Epon812包埋，制作超薄切片，电子染色，EM-2000EX电镜观察超微结构。 细胞周期及细胞凋亡的流式细胞术测定 分别收集处理组和对照组细胞，用预冷的PBS洗2次