酶类实验测定方法.docxVIP

实 验 方 法 李菁华 2016.6 一叶片相对含水量（RWC）采用烘干称重法测定 将叶片称鲜重（Fw）等量两份，然后一份浸入去离子水8h后称其饱和鲜重（Tw），将另一份材料于105℃烘箱中杀青30min，再在80℃下烘干48h至恒重记为干重（Dw），按如下公式计算 （Fw-Dw） 叶片相对含水量（%）= ×100% （Tw-Dw） 邹琦.植物生理学实验指导M .北京：中国农业出版社，2000 二根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定 一、原理 氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。 二、试剂 1）乙酸乙酯（分析纯） 2）连二亚硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末，俗称保险粉。 3）0.4%TTC（又名 红四氮唑、2,3,5-氯化三苯基四氮唑）溶液：准确称取TTC 0.4g，溶于少量水中，定容到100ml。 4）磷酸缓冲液（1/15mol·L-1，pH7.0）: A液：称取纯Na2HPO4·2H2O 11.876g溶于蒸馏水中成1000ml。 B液：称取纯KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中成1000ml。 用时取A液60ml，B液40ml混合即成。 5）1mol·L-1硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸5.5ml，边搅拌边加入盛有100ml蒸馏水的烧杯中，冷却定容至100ml。 三、实验步骤 1）TTC标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml容量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以乙酸乙酯作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。 2）取出大豆根系洗净，用滤纸吸干水分，称取1cm长的根尖样品0.2g，放入10ml烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液各5ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h（2h），此后加入1mol·L-1硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，10min后其他操作同上）。 3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3-4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出TTF。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2-3次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白实验作参比读出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量 四、结果计算 四氮唑还原强度（mg·g-1根鲜重h-1）＝四氮唑还原量（mg）/根重（g）×时间（h） 王晶英，敖红，张杰，曲桂琴.植物生理生化实验技术与原理M .哈尔滨：东北林业大学出版社，2003.7 三氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD） 一、原理 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应： 由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲臜（ 黄 色 ），继而还原生成二甲臜，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲臜 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。 二、试剂 1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别