应用RNAi技术沉默STAT1基因对哮喘小鼠INFγ、IL5、ICAM1表达的影响.pdfVIP

应用RNAi 技术沉默STAT1 基因对哮喘小鼠 INF- γ、IL-5、 ICAM-1 表达的影响 摘要 [1] 目的： 参与调节多种细胞因子和生长因子的细胞反应 ， STAT1 是连接各种膜受体和效应器之间的信号转导途径。它主要是调节细胞 的增值、分化、凋亡。在哮喘的发病中JAK/STAT 信号通路也起着重 要的作用。有研究表明，机体STAT1 的表达水平对免疫的调节和炎 [2] 症反应起着决定性的作用 。因此目前在呼吸系统的疾病中对 JAK/STAT 信号通路的研究同样集中在哮喘上。正因为JAK/STAT 信 号通路存在细胞因子特异性，因此阻断某种JAK/STAT 通路就可以阻 断其相对应的细胞因子的作用。RNA 干扰是一种强有效的抑制基因 功能的工具。它能够促进靶基因的转录产物mRNA 的降解，进而阻 止mRNA 翻译成相应的蛋白质。本实验应用RNA 干扰技术(RNA interference,RNAi)沉默转导子与转录活化子1 (signal transducer and activator of transcription 1 STAT1)基因，探讨其对支气管哮喘小鼠 蛋白与 、 、 的表达的影响。使基因治疗成 STAT1 INF-γ IL-5 ICAM-1 为可能导致治疗或者甚至预防性治疗支气管哮喘等气道慢性炎症性 疾病的新方法。 方法：32只4周龄BALB/C雌鼠随机分为4组；分别为正常组、PBS 组、空质粒组(随机片段RNAi)和siRNA组(pG-2) 。PBS组、空质粒组 和siRNA组分别用新鲜配制的OVA/Al(OH) 混悬液 3 (100ugOVA+ 1mgAl(OH) 干粉加入1mlPBS液配制而成)，分别于第1 3 天和第14天腹腔注射OVA/Al(OH) 混悬液，使BABL/C小鼠致敏；而 3 正常组用1mL的生理盐水腹腔注射。在第26-29天siRNA组浓缩的 siRNA40ul(100ug) 滴鼻；PBS组用40ulPBS液滴鼻；空质粒组用随机 片段RNAi40ul滴鼻。正常组用生理盐水滴鼻。在第28-30天正常组用 生理盐水滴鼻，PBS组、空质粒组及siRNA组用OVA溶液50ul(50ug) 滴鼻激发哮喘，在末次滴鼻后12小时引颈处死小鼠。通过单肺灌洗留 取肺泡灌洗液(BALF)进行细胞计数和分类计数。取BALF上清液，应 用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法(ELISA) ，检测其中的γ干扰素 (IFN-γ) 、白细胞介素5(IL-5) 、细胞间粘附分子1(ICAM-1) 的表达水平。 肺组织切片做免疫组织化学染色及HE染色。采用SPSS17.0软件进行 单因素方差分析和随机区组设计的方差分析，多个样本均数之间的多 重比较用LSD法，以P0.05表示有统计学意义。同时分析BALF 中炎 症细胞数与IFN-γ ，IL-5，ICAM-1间相关性。 结果：(1)正常组小鼠肺组织切片HE染色可见；支气管内壁光滑， 肺泡间隔菲薄，肺泡腔内未见炎性渗出物。空质粒组及siRNA组哮喘 小鼠肺组织病理切片HE染色可观察到：支气管粘膜水肿，支气管及 血管周围有大量的炎症细胞的浸润，以Eos为主；肺间质及肺泡腔内 也可见Eos 的浸润。细、小支气管内可见黏液栓。气道上皮多处断裂， 基底膜明显增厚且形态不规则。而siRNA组炎症细胞的浸润及黏液的 分泌较空质粒组与PBS组比较明显减轻。(2)STAT1蛋白主要表达与小 鼠的气道上皮细胞。(3)siRNA组STAT1蛋白表达水平明显低于PBS组 及空质粒组，但高于正常组。IL-5 、ICAM-1的表达水平亦呈类似改 变，而IFN-γ则呈相反的改变。(4)正常组的肺泡灌洗液中白细胞数 ， 嗜酸性粒