实验29 氨基移换反应的定性鉴定.DOC

实验29 氨基移换反应的定性鉴定 一、目的 1．学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理。 2．了解氨基移换作用在中间代谢中意义 3 进一步掌握纸层析的原理和操作技术。 二、原理 氨基移换酶也称转氨酶。它能催化a一氨基酸的a一氨基与一a酮酸的a一酮基互换，这种作用称氨基移换作用。 转氨酶的种类甚多，任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化。它们的最适pH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸一草酸乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶，GOT）及谷氨酸一丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶，GPT）活力最强，其催化反应如下： COOH | CH2 | CH2 | H-C-NH2 | COOH + COOH | C H2 | C=O | COOH COOH | C H2 | C H3 | C=O | COOH + CooH | CH2 | HC-NH2 | CooH 谷氨酸 草酰乙酸 α-酮戊二酸 天冬氨酸 COOH | CH2 | CH2 | H-C-NH2 | COOH + C H2 | C=O | COOH COOH | C H2 | C H2 | C=O | COOH + CH3 | H-C-NH2 | COOH 谷氨酸 丙酮酸 α-酮戊二酸 丙氨酸 测定转氨酶活性的方法很多，如分光光度法，纸上层析法及光电比色法等。本实验利用纸上层析法，检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸，证明组织内氨基移换作用。为了防止丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原，可加入碘乙酸或溴乙酸以抑制酵解作用或氧化作用。 三、材料、试剂和器具 （一）材料 饥饿16小时实验动物一家兔 （二）试剂 1、1%谷氨酸溶液（用1%KOH溶液中和至中性） 2、0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.4） 3、1%丙酮酸溶液（用1%KOH溶液中和至中性） 4、 0.1%碳酸氢钾溶液 5、0.05%碘乙酸溶液 0%乙酸 7、标准丙氨酸溶液（0.5%） 8、标准谷氨酸溶液(0.5%) 9、0.1%水合茚三酮乙溶液 10、酚溶剂：在大烧杯中，加蒸馏水40毫升，再加入新蒸馏的无色的苯酚150克，在水浴中加热搅拌，混合至苯酚完全溶解。将该溶液倒入盛有120毫升蒸馏水的500毫长分液漏斗内，轻轻振荡混合，使其成为乳状液。静置7~10小时，乳状液变成两层透明的溶液，下层为水饱和的酚溶液（即酚溶液）放出下层贮存于棕色试剂瓶备用。 （三）器具 1、解剖刀、剪刀及镊子、匀浆器 2、圆规、铅笔、直尺 3、毛细管 4、电吹风机 5、1.5克肝脏，放入匀浆器中，加3毫升磷酸缓冲液，研磨成浆，在2500转/分的条件下离心5分钟，取上清液即为酶液。 （二）酶促反应： 取2支干净试管，按下表加入试剂。 试管编号 试剂 1 （待测） 2 （对照） 1%mol/L谷氨酸溶液（滴） 10 10 1%丙酮酸钠溶液（滴） 10 10 1/15M pH7.4磷酸缓冲液（ml） 2 2 0.05%碘乙酸（滴） 5 5 酶液（滴） 20 0.05%碘乙酸（滴） 30%乙酸（滴） — 5（立即滴加并摇匀） 煮沸（min） — 5 将1、2号试管摇匀，置于37oC恒温水浴中保温30min 30%乙酸(滴) 5 — 再将1、2号管置于沸水中加热10min，使蛋白质沉淀。取出后在流水下冷却，过滤分别收取滤液备用。 (三)纸上层析法检查 取15厘米直径的园形层析泸纸一张，在圆心处用圆规划一3厘米直径的同心园，通过中心将滤纸划成四等分，用0.1厘米粗的毛细管分别吸取上述滤液和标准谷氨酸和丙氨酸溶分别点在小圆周上，点样直径0.3厘米，待点样斑点干燥后再点样，如此重复3~4次。 在滤纸的圆心上剪一小孔直径约1~2毫米，另取一滤纸小条将其下端剪成刷状，卷成“灯芯”插入中心小孔，但不使灯芯突出纸面。然后将圆形滤纸平放在盛有层析溶剂的培养皿中，使“灯芯”向下接触溶剂，另一大小相同的培养皿盖在滤纸上（如图29）。此时溶剂经过灯芯上升到纸上向四周扩散，直到溶液移动到距纸边1厘米处，打开培养皿上盖，取出滤纸，拔去灯芯，用吹风筒吹干，然后喷上茚三酮溶液，在60oC烘10~15分钟，或用吹风筒的热风吹干，滤纸上即可看到紫红色的氨基酸斑点，计算出各斑点的Rf值。分析比较层析图谱，确定各点的氨基酸组成，并解释。 图29-1 园形层析示意图 五、注意事项 1、提取酶液中，肝脏最好用缓冲液把血块洗去，然后再剪碎研磨，肝与缓冲液的比例一般为1：3（W/V）左右较为适合。 2、把滤纸下端剪成刷状，以增加滤纸毛细管现象以便均匀吸取溶剂，灯芯不能突出纸面，是为了使溶剂的扩展均匀，不致影响层析结果。， 六、实验