实验3质粒的提取和鉴定090226.pptVIP

注意 EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去 * * * * * * * * * * * * 碱变性法小量提取质粒DNA的限制性酶切 厦门大学医学院 分子生物学实验教学组 目的 掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法:最常用的提取基因工程中运载基因的载体 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基因和实验目的选择合适载体与限制性内切酶，设计构建体外重组分子 质粒(plasmid)是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。 质粒DNA的提取方法 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需) 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求 碱裂解法 基本原理： 1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来 2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样） 3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光 原理示意图 限制性核酸内切酶: 一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。 限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端带磷酸基团，3’端为-OH。 限制性核酸内切酶分类 识别切割特性 催化条件 是否具有修饰酶活性 至2005年1月，共发现限制酶3681种 Ⅰ 型59种 Ⅱ 型3612种 Ⅲ 型10种 商业化的限制酶有 588 种，在 Ⅱ 型限制酶中共有 221 种特异性。 Ⅱ型限制与修饰系统 占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口：5’端突出，3’端突出和平末端。 酶切反应中应注意以下几个问题： 1. 内切酶：不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点和形成的粘性末端； 2. 内切酶的用量：根据内切酶的单位和DNA用量而定。使用中一般以1 μg DNA用2-3U酶进行酶切为宜； 3. 内切酶体积：不能超过反应体系的10%，因内切酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切酶的活力； 4. 操作条件：应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。 5. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。 反应缓冲液： 1. 反应缓冲液: 主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+ 为内切酶的辅基； A. Tris-HCl维持反应体系的PH值在7.2~7.6之间； B. NaCl浓度： 低盐(10mM NaCl) 中盐(50mM NaCl) 高盐(100mM NaCl) 2. 酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37℃，如EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ等，也有如BclⅠ需在50℃下进行反应。 3. 酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是酶/DNA＝2~3，12小时即可充分酶解。 4. 酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下 ， 0.05mL反应混合物中, 1小时消化1μg底物DNA的酶量为1单位(1U)。 三 质粒提取实验材料与试剂 （一）实验材料： 过夜培养