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基因工程郭玉柱 1.1基因工程的基本操作工具 1、概念：定向改造生物性状，解读2、原理：基因重组3、操作水平：DNA分子水平4、操作工具：（1）限制性核酸内切酶---分子手术刀 1）来源：微生物（原核+真菌） 2）作用特点：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 3）结果：形成平末端或粘性末端（2）DNA连接酶—分子缝合针1）种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA 连接酶2）作用特点：使两个DNA分子片段之间形成磷酸二酯键，从而使之连接在一起。 E.coliDNA连接酶只连接粘性末端，T4DNA 连接酶两种末端都能连，但连接平末端效率低。 比较限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶的异同点？相同点：都作用于磷酸二酯键不同点：1）限制酶切割DNA的磷酸二酯键2）DNA连接酶连接双链DNA片段形成磷酸二酯键。3）DNA聚合酶使单个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键。4）RNA聚合酶使单个核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键。 （3）运载体---分子运输车1）种类：质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒2）天然质粒不能作为运载体，需要加工修饰后才可以。3）质粒作为运载体满足的条件：1、有一个至多个限制酶切位点，便于目的基因插入。2、能在宿主细胞中自我复制或整合到染色体DNA上，随染色体DNA同步复制。 3、具有标记基因（如抗生素抗性基因、荧光标记基因），便于将含有目的基因的细胞筛选出来。4、大小适宜，对宿主细胞无伤害。 2、将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射法 ②程序： 归纳: 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法等 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定： 蛋白质工程1、概念2、原理3、是基因工程延伸、与基因工程对比4、途径：见教材。 二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心 1、目的： 所需物质： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 它们各自的作用是什么? 2、基因表达载体的组成： 复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因 它们各自的作用是什么? ①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。 注意 三将目的基因导入受体细胞 （一）转化： （二）方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法(双子叶） 基因枪法（单子叶） 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达 1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 ①农杆菌特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力 ②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 ③过程： ④优点 （2）基因枪法 （3）花粉管通道法 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵（或胚胎干细胞) 新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 ①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 ②方法： 用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子 CacL2可以改变微生物细胞壁的通透性 四、目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功 （一）、检测 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 ①.首先取出转基因生物的基因组DNA ②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针 ③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中 （1）方法: DNA分子杂交 （2）过程: （二）、鉴定（个体生物学+分子生物学水平） 2、检测目的基因是否转录出了mRNA 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定、抗病鉴