生化技术原理.docx

生命大分子物质的制备 某一骨骼肌的无细胞粗抽提液每毫升含蛋白质32mg，在适宜条件下，10／-l该抽提液以每分钟O．14,umol的速度催化一个反应。用硫酸铵沉淀法分级分离50ml上述抽提液，将饱和度为20% - 40%的沉淀物重新溶于10ml溶液中，测得其蛋白质含量为50rng/m1’取ioy.i该溶液催化一反应，其速度为每分钟o．65弘mol。试计算纯化倍数和回收率。(2. 97，92.8%) 第二章沉淀法 1．兔肌醛缩酶的p常数与盐析常数（在离子强度为摩尔浓度时）分别为6.30和2. 84。试求硫酸铵浓度分别为2mol/L、3mol/L时的溶解度。(4.2mg/ml，6.03 X10-3 mg/ml) 2．含25%硫酸铵饱和度的细胞色素c溶液150ml，需加多少克硫酸铵或多少毫升饱和硫酸铵溶液，才能使其达55%饱和度? (28. 95g, 100ml) .10．某一蛋白质的盐析范围为饱和硫酸铵30%-60%，试简述具体操作（若有500ml盐析液）。 第三章 吸附层析 7. 利用薄层层析如何??定蛋白质的纯度？ 第四章疏水层析 1．疏水作用层析的固定相和流动相与普通吸附层析有何区别？为什么？(P63 , T1) 第五章离子交换层析 1．离子交换剂由哪几部分组成？何为阳离子和阴离子交换剂？ 2．弱酸性和弱碱性的纤维素离子交换剂分别适宜在哪些pH范围内应用？为什么？ 7．影响离子交换剂膨胀度的因子有哪些？其中哪个为关键因子？为什么？ 8．在层析柱中污染杂质后应如何处理？为什么某些亲水性离子交换剂在含乙醇的乙酸盐溶液中可以防止微生物污染？ 9．试设计利用离子交换剂分离一种含等电点分别为4．0、6.0、7.5和9.0的蛋白质合液的方案，并简述理由。并绘制洗脱曲线。 10．梯度溶液的变化速率、交换剂的膨胀程度、装柱的均匀度等因子，对样品的分辨率有何影响？ 11．梯度溶液的变化速率是受哪些因素控制的？试举例说明如何借助速率变化来提高分离效果？ 13．用离子交换剂测定蛋白质的等电点时，为什么一定要用强性离子交换剂？ 第六章凝胶过滤 1．凝胶过滤分离大分子物质的机制是什么？分子质量为8 XI04Da和10Xl04Daa的蛋白质能否在Sephadex G75柱中分开？为什么？ 2．在操作方面，凝胶过滤与离子交换层析有何异同处？ 4．在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为140ml，其外水体积和总体积分别为60ml和200ml，求分配系数是多少?(o．57) 5．在5．Ocm X 60cm的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最多加样体积是多少毫升？(589ml) 7．制备合格的凝胶层析柱应注意哪几点？ 8．概述哪些因子影响凝胶过滤的分辨率，为什么？ 2．弱酸性和弱碱性的纤维素离子交换剂分别适宜在哪些pH范围内应用？为什么？ 第七章 亲和层析 1．在亲和层析时，为什么床体积比较小？为什么无亲和力的物质往往只能产生一个层析峰？ 2．简述亲和层析的分辨率比一般吸附层析高的原因。 5．在操作及应用方面，亲和层析与吸附层析、离子交换层析、凝胶层析有哪些异同点？ 6，在含A、B、C、D四种蛋白质组分的混合液中，A和B均为含有葡萄糖链的糖蛋白，其pI分别为5.0和5.5，而C和D的相对分子质量分别为40 000和50 000，试设计用层析法分离它们的方案。 第八章聚焦层析 1．概述多缓冲剂和多缓冲离子交换剂的性质。 2．在聚焦层析和阴离子交换层析时，pH梯度的形成有何异同点？ 3．简述聚焦层析分离蛋白质的主要操作步骤。 4．试述用聚焦层析分离pI 6．0、6.5和7.5三种物质的程序。 第九章高效液相色谱 4．反相高效液相色谱与正相高效液相色谱的根本区别是什么？前者又与疏水层析有何不同？ 5．反相高效液相色谱为什么不适合分离分子质量大的蛋白质？ 高效液相色谱与气相色谱的异同点？ 疏水层析和反相层析(reversed phase chromatography)分离生命物质的依据是一致的，即视有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性大小，进而设法将有效成分分离出来。但是，在反相层析中，所用的载体结合的配体密度大、疏水性强，对蛋白质类物质具有较大的吸附力，欲将吸附物解析下来，需用含有机溶剂（降低极性）的流动相洗脱，才能以偿。由于析中的载体结合的配体密度小，疏水位期，刷阻H一矿，，，一，一‘洗脱液的极性降低，常常会引起大分子活性物质变性，，因此反相层析一般较适合分离纯化小分子质量的肽类和辅基等物质。疏水层析所用载体的性能与反相层析不同，即疏水层析中的载体结合的配体密度小，疏水性弱，对蛋白质及其复