溶血空斑.docVIP

溶血空斑试验 实验目的：1.掌握PFC试验的基本原理及实验方法；2. 了解PFC试验的临床意义。 原理：溶血空斑试验 (plaque forming cell assay ， PFC) 是 Jerne 于 1963 年设计的用于体外检查和计数某种抗体形成细胞的一种方法。该方法是将经绵羊红细胞（SRBC）免疫过的小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，于37℃作用下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑试验具有特异性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。 材料与试剂：1.动物 C57 BL/6小鼠 2.补体 豚鼠新鲜血清3.主要试剂：琼脂，绵羊血红细胞（SRBC），PBS（pH7.2）4.仪器设备：37°C恒温箱，平皿（5.5cm*1.5cm）水浴箱，离心机，显微镜，细胞计数板 方法： 小鼠免疫及脾细胞悬液的制备 （1） SRBC悬液制备：取无菌脱纤维绵羊血，用PBS洗涤3次（1500r/min,离心5min）,取积压红细胞悬于PBS中，使成20%浓度，细胞计数后调整浓度2.0×109/ml。 （2）小鼠免疫：实验组每只小鼠腹腔注射上述SRBC悬液0.2ml，对照组注入等剂量的PBS。 （3）脾细胞悬液制备：将免疫后四天的小鼠断颈处死，取脾脏，PBS洗涤后置于小烧杯上200目不锈钢筛网,用注射器针芯研磨成悬液,洗涤两次（1200r/min,离心5min），调整细胞数为1.0×107/ml，置4℃冰箱备用。 2. 琼脂凝胶板的制备 (1) 底层琼脂制备：用PBS配置1.4%琼脂，加热融化后倾注于水平位置的平皿内，每皿5ml，凝固后去盖置于37 ℃恒温箱中1h,取出平皿，加盖后置于4℃备用。 （2）顶层琼脂制备：用PBS配置 0.7%琼脂，溶化后置于42℃水浴中，备用。取一只试管置于42℃水浴中，依次加入0.7%琼脂2ml,2.0×109/ml SRBC悬液0.2ml，1.0×107/ml脾细胞悬液0.2ml，迅速混匀后倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，使之均匀平铺凝固后，静置15min，放于37℃温育1h。 3. 加补体 从温箱中取出平皿，每皿加1：5稀释的豚鼠新鲜血清1.5ml，继续放于37 ℃温箱中孵育30min后取出，观察结果，也可在室温下放置1h, 4℃过夜，翌日后观察结果。 4. 肉眼或体视镜下观察溶血空斑的溶血情况 注意事项： SRBC应新鲜，洗涤不超过三次，细胞变形或脆性增大者都不能使用。免疫用SRBC的量，尾静脉注射以2.0×104/0.2ml为宜，腹腔注射以4.0×108/ml为宜，注射太少形成空斑少，太多则不能形成空斑。 采取脾细胞的时间以免疫后四周为宜，过早或过晚空斑都形成较少。 3. 0.7％琼脂必须置4～49℃水浴融态保温。如温度过高会导致SRBC溶血或所加入脾细胞的死亡。温度过低则在操作过程中琼脂发生凝固，影响上层琼脂平板的制备4. 离体的脾细胞应置4℃冰箱保存，防止抗体分泌和细胞死亡。5. 在制备试验平皿时，对于所有玻璃器皿和各种试剂，均需预温，各种试剂加入离心管后，应与0.7％琼脂迅速充分混匀，然后立即倾倒于底层琼脂上，并避免倾入气泡。6. 加入的补体应均匀覆盖于表层琼脂上。