基因工程制药的下游技术-课件.pptVIP

第八节 基因工程制药的下游技术 一、重组工程菌的培养 二、 基因工程药物的分离纯化 三、 基因工程药物的质量控制 四、 基因工程药物制造实例 一、 重组工程菌的培养 （一）、基因工程菌的培养方式 分批培养(batch culture） 补料分批培养(fed batch culture） 连续培养(continuous culture） 透析培养(dialysis culture） 固定化培养(immobilized culture） 分批培养 定义：将种子液和培养基一次性装入反应器内，经过一定时间培养后一次性出料的培养过程。 补料分批培养：将种子接人发酵罐中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法 连续培养 定义：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养 由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。两阶段连续培养 透析培养 定义：利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响 膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响 固定化培养 基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利 （二）、基因工程菌的培养工艺 生物工程菌为含有带外源基因的重组载体的微生物细胞 生物工程菌的发酵生产的目的是希望能获得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染 发酵水平的好坏还直接影响产品的纯化及其质量 2.1 培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达 使用不同的培养基对菌体生长和外源基因表达有较大的影响 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖及果糖等 氮源：酵母粉、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵及氯化铵等 无机盐、微量元素、维生素、生物素等 2.2 接种量的影响 接种量：指移入的种子液体积和培养液体积的比例，它的大小影响发酵的产量和发酵周期 接种量小，菌体延迟期较长，不利于外源基因的表达。采用大接种量，可以缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会；但接种量过高往往会使菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长 2.3 温度的影响 温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子合成等水平上 温度影响蛋白质的活性和包含体的形成 2.4 溶解氧的影响 溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，溶解氧浓度对菌体生长和产物生成的影响很大。菌群在大量扩增过程中，耗氧进行氧化分解代谢，饱和氧的及时供给很重要 采用调整搅拌转速的方法可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量（发酵前期采用较低转速，培养后期采用高搅拌转速） 2.5 pH的影响 在发酵过程中pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件决定 采用两阶段培养工艺，培养前期阶段着重于优化工程菌的最佳生长条件（最佳pH范围为6.8-7.4 ），培养后期阶段着重于优化外源蛋白的表达条件（最佳pH为6.0-6.5） 2.6 其他影响 诱导时机的影响：一般在对数生长期或对数生长后期诱导表达 诱导表达程序的影响 二、 基因工程药物的分离纯化 基因工程药物的特点 目的产物在初始物料中含量低 含目的产物的初始物料组成复杂 目的产物的稳定性差 种类繁多 应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源等 （一）、建立工艺需了解各种因素 含目的产物的初始物料的特点 物料中杂质种类和性质 目的产物特性 产品质量要求 （二）、分离纯化的基本过程 细胞破碎 固液分离 浓缩与初步纯化 高度纯化直至得到纯品 成品加工 （三）、细胞的破碎方法 物理破碎法：高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎法、高压挤压法 化学破碎法：渗透冲击、增溶法、脂溶法 生物破碎法：酶溶法 （四）、固液分离 离心沉淀：高速离心和超速离心 膜过滤：微滤、超滤和反渗透 双水相萃取 （五）、重组蛋白质的分离纯化 分离纯化主要依赖色谱分离方法。分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱等 色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段，其优点是该法具有多种多样的分离机制、设备简单、便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应 离子交换层析 离子交换层析(ion exchange chromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法 离子交换色谱分辨率高、