脂肪氧化.doc

过氧化脂（LPO）是体内细胞膜性结构中的多介不饱和脂肪酸受到氧自由基的作用生成的脂质过氧化，膜脂质的过氧化 丙二醛（MDA）分子式OHC-CH2-CHO ，分子量72.0634 　　自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。 　　机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。如：醛基（丙二醛MDA）、酮基、羟基、羰基、氢过氧基或内过氧基，以及新的氧自由基。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂，即非自由基性的质类分解产物，而且通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用。因此，初始的一个活性氧能导致很多的质类分解产物的形成，这些分解产物中，一些是无害的，另一些则能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。氧自由基不但通过生物膜中的多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过质氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤，因此测定MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。测定原理 　　测定方法是丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5acute;-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川），该物质在532nm处有一吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收。根据其532nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。 　实验十五 丙二醛（MDA）的测定 目的和要求 掌握用试剂盒测定丙二醛的原理和方法。了解丙二醛测定的临床意义。 原理 机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacid,PUFA）,引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物，如：醛基（丙二醛MDA）、酮基、羟基、羰基、氢过氧基或内过氧基，以及新的氧自由基等。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂，即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支连反应，放大活性氧的作用。因此，初始的一个活性氧能导致很多脂类分解产物的形成，这些分解产物中，一些是无害的，另一些则能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸（PUFA）的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化的分解产物引起细胞损伤。因而测试MDA的量常常可以反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。 过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。 操作步骤 取4支干净试管，按下表进行操作。 管号 试剂 标准管 标准空白管 测定管 测定空白管① 10nmol/ml标准品/ml 0.1 ? ? ? 无水乙醇/ml ? 0.1 ? ? 血清（桨）②/ml ? ? 0.1 0.1 试剂A/ml 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀 （摇动试管） 试剂B/ml 3.0 3.0 3.0 3.0 试剂C/ml 1.0 1.0 1.0 ? 50%冰醋酸/ml ? ? ? 1.0 加入试剂后，用旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，刺一小孔，95℃水浴40min③,取出后流水冷却，然后3500-4000r/min，离心10min。取上清， 532nm处，1cm光径，用蒸馏水调零，比色测定各管吸光度值。 ? 丙二醛(MDA)含量的测定 测定步骤 称取剪碎的试材1g，加入2ml10%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆在4000r/min离心10分钟，上清液为样品提取液。吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml0.6%硫代巴比妥酸溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下的吸光度。 计算 (3-6) 式中：C—MDA的浓度， ； A450，A532 和A600—分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。