低表达Cbfa1基因的人牙周膜细胞模型的建立及鉴定论文.docVIP

　　低表达Cbfa1基因的人牙周膜细胞模型的建立及鉴定论文 【摘要】 目的：构建针对核心结合因子a1（Cbfa1）的mU6小干扰RNA载体，并将其转染到人牙周膜细胞hPDLCs，观察其干扰效果，以期建立稳定的低表达Cbfa1基因的hPDLCs模型. 方法：设计针对Cbfa1基因编码区的寡核苷酸链，体外退火后克隆入经双酶切线性化的小干扰载体mU6中，对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定. 以脂质体法将mU6空载体和重组质粒分别导人hPDLCs细胞系. 用含G418的培养液筛选，挑取阳性克隆后用RTPCR技术检测各hPDLCs克隆内Cbfa1 mRNA水平的表达情况. 结果：经酶切鉴定及DNA测序，重组质粒Cbfa1siRNA中插入的目的基因片段与预计片段完全一致. G418筛选转染细胞4U6空载体的细胞克隆株hPDLCsmU6和稳定转染重组质粒的细胞克隆株hPDLCssiRNA. 经RTPCR鉴定.freelU6载体为美国Michigan大学医学院Tumer教授赠送；T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶（TaKaRa公司）；脂质体转染试剂Lipofectamine2000（美国Invitrogen公司）；RPMI 1640，G418（Gibco公司）；RNA抽提试剂盒（上海华舜公司）. 1.2Cbfa1 siRNA载体的构建根据GenBank Cbfa1基因的已知序列设计其siRNA的序列：上游引物：5′tttgcggagtagttctcgtcatacaatgacgagaactactccgcttttt3′,下游引物：5′ctagaaaaagcggagtagttctcgtcattgtatgacga gaactactccg3′. 上述序列用BLAST软件进行同源分析证实为Cbfa1高度保守后，由 Sangon公司合成. 退火后酶切mU6质粒，行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，回收线性化载体，将退火产物和回收产物定量后于16℃连接16 h，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌. 37℃培养12～18 h. 挑选单克隆扩增后进行酶切鉴定和DNA测序. 1.3细胞培养与转染将hPDLCs常规培养于100 mL/L RPMI 1640培养液中. G418筛选浓度的确定：将hPDLCs接种于6孔板（2×105/孔）. G418按100，200，300，400，500，600，700，800 mg/L的终浓度加入各孔细胞，观察细胞生长状况，以第8日细胞全部死亡的最低浓度为筛选浓度. 确定筛选浓度为300 mg/L. 取对数生长期hPDLCs，接种于6孔板（5×105/孔），在50 mL/L CO2培养箱中过夜，直至细胞80%饱和. 在1 mL RPMI 1640培养液中加10 μg质粒（分别加入重组质粒mU6Cbfa1，空载体mU6）振荡混匀，加入lipofectinamine脂质体悬液10 μL，室温温育15 min. 弃去培养基,用无血清培养基洗2次, 逐滴缓慢加入预先制备的质粒ＤＮＡ/脂质体复合液, 37℃，50 mL/L CO2培养箱中温育5 h后补充1 mL 200 mL/L新生牛血清的RPMI 1640培养液，继续培养. 30 h后改用含G418 300 mg/L的培养液筛选，挑取阳性克隆并进行扩增培养. 设立mU6空载体转染细胞作为对照. 阳性克隆株分别命名为hPDLCssiRNA和hPDLCsmU6细胞，以RTPCR进行鉴定. 1.4RTPCR用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA并定量，取10 μg的总RNA和Oligo dT(15) 4 μL进行反转录，于70℃ 10 min后置于冰上，再依次加入5×Buffer 10 μL，dNTP 2 μL，AMV 1 μL，RNasin 1 μL，去离子水补至50 μL，42℃孵育2 h后冰冻保存. 常规进行PCR扩增，反应引物Cbfa1: 5′cacctcggaactgaacccat3′和5′gcctccacgccatcactct3′；βactin: 5′agcgggaaatcgtgcgtg3′和5′cagggtacatggtggtgcc3′. 将PCR反应产物行12 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外线灯下观察并照相. 2结果 2.1Cbfa1的小干扰RNA载体的构建和鉴定根据GenBank提供的Cbfa1基因cDNA序列，设计合成发夹样Cbfa1 siRNA. mU6Cbfa1 siRNA真核表达质粒和空载体被XbaⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，分别形成400 bp和1100 bp的DNA片段，与预计片段长度相同（图 1）. 2.2Cbfa1低表达的细胞模型的建立G418筛选转染细胞4 U6明显降低，说明成功建立了Cbf