凋亡相关蛋白Apr论文.docVIP

　　凋亡相关蛋白Apr论文 李袁飞 师建国 郭爱林 朱国强 闫庆国 【关键词】 Apr Cloning, sequencing and preliminary expression of apoptosis related protein 2 【Abstract】 AIM: To clone and express the apoptosis related protein 2 (Apr2) from the model of the apoptosis cells of HL60. METHODS: The model of apoptosis cells of HL60 the cells and mRNA plify the apr2 coding region and the PCR product ed. SDSPAGE shoed to estimate the percentage of the rebinant protein in the total bacteria protein, inary expression product of fusion protein has been obtained, proved subtractive hybirdization, ISH）克隆出了10个凋亡相关新基因，并在GenBank中登录，其中凋亡相关蛋白Apr2的生化性质、结构、功能以及与凋亡的确切关系还不清楚，国内外文献尚无研究报道. 我们利用HL60细胞凋亡模型，对Apr2基因编码区进行克隆、表达及序列分析.freel购自Promega公司；PGEX4T2购自Pharmacia公司; TRIzol总RNA提取试剂盒购自Gibco brl Life Technology公司; TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)逆转录PCR试剂盒、限制性内切酶XhoⅠ，BamHI，T4 DNA连接酶购自TaKaRa Biotech公司；RPMI 1640购自华美生物制品有限公司; 新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所； GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder及GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder plus购自Fermentas公司. 1.2方法 1.2.1引物设计与合成以GenBank中人HL60 cDNA编码区序列（ACCESSION：AF143236）为模板，设计引物，序列如下：5′ GGATCCATGGTTTCCTTGTGGGTG；3′ CTCGAGTTAATCCCAAACGGTGGCTG；并在上游引物中加入BamHI酶切位点，在下游引物中加入XhoⅠ酶切位点(下划线部分为酶切位点). 引物由上海生工生物工程有限公司合成. 1.2.2HL60细胞凋亡模型的建立［2,3］将处于对数生长期的HL60细胞稀释至5×106个 mL-1，加入1 mmol L-1 ATRA（全反式维甲酸）2 μL，使培养液中ATRA终浓度为1 μmol L-1，培养12 h后收集细胞. 1.2.3RTPCR取约5×106个HL60凋亡细胞，按TRIzol总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,取5 μL用紫外分光光度仪测定样品浓度. 提取的RNA逆转录合成cDNA，取上述引物，进行PCR扩增. 反应参数为：95℃预变性5 min， 95℃ 50 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s；共30个循环，72 ℃延伸5 min；4℃保存. 取PCR反应产物5 μL，10 g L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定. 1.2.4Apr2克隆载体的构建参照文献［4，5］，PCR产物经电泳鉴定后，试剂盒回收目的片段，并与PGEMTEasy连接，转化E.coli DH5α,利用氨苄青霉素抗性筛选重组克隆. 提取阳性克隆的质粒DNA，进行BamHI和XhoⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定. 初步鉴定正确的重组克隆对其进行序列分析. 1.2.5Apr2重组表达载体的构建将用BamHI，XhoⅠ双酶切纯化后的目的cDNA apr2亚克隆到经同样双酶切后的载体PGEX4T2中，质粒与插入DNA的克分子数比为1∶3，得到的重组表达质粒PGEX4T2/ apr2. 经BamHI和XhoⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定. 1.2.6Apr2编码区cDNA在E.coli的表达［6］将表达载体PGEX4T2/apr2转化感受态E.coli，在含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上过夜，次日挑选一个单菌落接种LB液体培养基中过夜，取100 μL摇起的菌液加至5 mL新鲜LB培养基中37℃，2.5 h后，取1 mL菌液做诱导前对照，余加入5 μL 0.42 mol L-1的异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）诱导3 h后