应用LacZ报告系统研究白念珠菌HYR1基因的启动子活性论文.docVIP

　　应用LacZ报告系统研究白念珠菌HYR1基因的启动子活性论文 .freeloters concerned candida albicans yeast-hyphal regulation gene(HYR1).Methods Sequence bet of the start of transcription and 43bp do of this site oters ed EGY48 yeast.Results -400～-200bp of candida albicans HYR1 gene had activity as promoter.Conclusion In the region of -400～-200bp of candida albicans HYR1 gene，there ent concerned ent of Microbiology and Immunology，University of Tennessee）所赠，质粒图谱如图2。 图1 克隆片段示意图 图2 PNG17质粒图谱 1.4 重组体的构建 重组体中所含的启动子即是所要研究的白念珠菌菌相转换基因HYR1转录起始位点上游的各个大小不同的DNA片断。它们具有相同3’端，分别对应于HYR1基因上游-1800~+43bp，-1400~+43bp，-1000~+43bp，-600~+43bp，-400~+43bp，-200~+43bp，来自于以白念珠菌ATCC10261染色体DNA为模板的PCR扩增产物，相应的重组体分别命名为pHYR1.8、pHYR1.4、pHYR1.0、pHYR0.6、pHYR0.4、pHYR0.2。启动子5’端引物序列分别为：pHYR1.8：5’-CCGTCGACCCAATTCCCCCATTAGAACAC-3’; pHYR1.4：5’-CCGTCGACTTGGTTATGAACACTGCAACT-3’;pHYR1.0：5’- C C G T C G A C A G A A A G G G A A AGGCGTGTAAGG-3’;pHYR0.6：5’- CCGTCGACCACGAATACAATGGGAACACGA-3’;pHYR0.4：5’- CCGTCGACGGCAAATGCTTAGTATGACAGC-3’;pHYR0.2:5’-CCGTCGACCACACGCCTATTATATGCACAG-3’（pHYR1.8，1.4，1.0等是笔者为方便叙述而命名的重组体，该重组体的构建包括二部分，第一部分是扩增HYR1基因上游的DNA片段，共6段）。 上述6种重组体的3’端引物相同，序列为：5’-GCGTCGAGTGGTTTCAACAAACTGGAATACTT 3’端。两端引物分别含8个保护碱基和限制性内切酶SalI与XhoI酶识别位点，它们分别是SalI酶:CCGTCGAC;XhoI酶:GCGTCGAG。PCR按常规方法进行（PE-9600 PCR扩增仪）。取5μl产物电泳判断是否扩增成功，将扩增成功的产物用PCR产物回收试剂盒回收，并电泳估计其浓度。取1μg左右的产物用XhoI及SalI酶酶切并回收(标准酶切体系)，电泳估测浓度并保存。将含PNG17的菌用液体LB摇瓶约30ml培养过夜，用质粒小抽试剂盒抽提质粒并电泳检测浓度与质粒大小。取1μg左右的质粒用上述两酶酶切，碱性磷酸酶脱磷并胶回收，电泳估测浓度并保存。取合适量的已酶切的各目标片断与酶切的质粒载体用T4连接酶连接，4℃过夜。转化感受态大肠杆菌DH5α，涂板培养过夜。挑取转化子划线分离，并菌落PCR鉴定是否含有插入片断。将鉴定阳性的菌落小摇培养（3ml LB），抽提质粒，送测序。阳性克隆保种。 1.5 酵母菌EGY48的转化 将EGY48接种于YEPD液体培养基中(5ml)，培养过夜（16~18h），菌液离心（14k，30s），弃上清液，用1ml双蒸水洗涤1次，离心弃上清液。用1ml LiAC/TE洗涤1次，吸干剩余液体，振松菌体，加入50μl LiAC/TE，5μl鲑精DNA，1~2μl转化质粒，混匀，振动至无菌块，加入300μl LiAC/TE/PEG，振匀，置于30℃30min，再转置于42℃热激30min，再放回30℃5min，离心12k，1min，弃上清，加入100μl双蒸水，用枪吹打混匀，吸50μl于平板（SC-u/SGR-u）上涂布，30℃培养2~3天（48h以上）。 1.6 β-半乳糖苷酶(LacZ)活性的定性测定 在SC-u/SGR-u培养基（pH 7.0）中加入β-半乳糖苷（Xgal）1mg/ml和1%的脯氨酸，常规浇取petri培养皿。将SC-u/SGR-u平板上生长的酵母菌菌落接种其上，这些菌落为不同的酵母转化子，分别含有以上构