应用real-time PCR定量检测小麦条锈菌潜伏侵染量方法的建立.pdfVIP

植物病理学报 ACTAPHYTOPATHOLOGICA SINICA 40(5)：504—510(2010) 应用 real—timePCR定量检测小麦 条锈菌潜伏侵染量方法的建立 潘娟娟 ，骆 勇 ，黄 冲 ，孙振宇 ，赵 磊 ，闰佳会 ，马 占鸿 (Lf1同农、I大学植物病理学系，农、I部植物病理学重点开放实验室，北京 100193； 。美闰加州人学植物病理学系Keamey农、『研究中心，ParlierCA 93648) 摘要：小麦条锈病是我同小麦主要病害之一 l火速、及时地诊断与定量监测处丁潜育状态下的病叶，对准确估计越冬、越 夏后的病情 ，制定正确的防治方案具有重要的意义。根据小麦条锈菌Pucciniastrifiormis的 一tubilin堆 序列设计对该病 原菌的种具有特异性的引物betaf／betar，并分别存普通PCR和 real—timePCR扩增时对该引物的特异性和灵敏性进行了测 定。结果表明该引物对小麦条锈菌特异性高，可稳定扩增m243bp的 目标条带。Real—timePCR的灵敏度为普通 PCR的 100倍。应用此特异性引物，建立了real—timePCR测定系统，定量测定了条锈菌在小麦叶片接种后组织内的DNA随时间 的变化。结果表明，存接种后 12h，可存小麦叶片内榆测到条锈菌，且条锈菌存小麦叶片内潜育期间随时 日『J呈指数增长。 接种第6d后叶片内的菌量有明显的增加。建 的小麦条锈菌的real—timePCR早期定量测定方法，为及时、快速监测小麦 条锈病存潜育期 的发病规律以及为该病的预测、防治提供依据。 关键词：小麦条锈病；潜伏侵染；real—timePCR；分子流行学 Quantificati0noflatentinfectionsofwheatstriperustbyusingreal—timePCR PAN． Juan-juan，LUO Yong’一，HUANG Chong， SUN Zhen—yu， ZHAO Lei， YAN Jia—hui，MA Zhan—hong (D‘epartmentofPlantPathology，TheKeyLaboratoryofChinaMinistryAgriculture，ChinaAgriculturalUni— versity，Beijing100193，China；DepartmentofPlantPathology，UniversityofCalifornia，KeameyAgriculturalCenter，Parlier CA93648，USA) Abstract：WheatstriperustcausedbyPucciniastriiformisisoneofthemostimportantwheatdiseasesinChi— na．Earlydetectionand monitoring ofthedevelopmentoflatentinfectionareimportantin diseaseprediction andmanagement．Inthisstudy，P．striiformis—specificprimerpair，betaf／betar，wasdesignedaccordingtothe sequenceof_lB—tubilingenetodetectthepathogenexistinginwheatleaveaslatentinfection．Specificityofthe designedprimerpairwasconfirmedbytestingthegenomeDNA ofvariousspeciesofwheatpathogens．A 243 bpfragmentofgenomeDNA wasstablyamplifiedfrom 尸．striiformis．butnotfrom theotherwheatpatho— gens．Thereal—timePCR assaywasgeneratedtoquantifythetargetDNA．SensitivitiesofregularPCR andre— al—timePCR assaywerecomparedbyusingserialdilutionsoftemplateDNA．Thesensitivityofreal—timePCR wasabout100一timeshigherthant