血红蛋白的提取和分离(上课用)解析.pptVIP

装配好的凝胶柱 ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 2、凝胶色谱柱的装填 50cm高 3、样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 3.样品的加入和洗脱 （3）样品加入与洗脱 注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 收集得到的纯化后的蛋白 注意事项 1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2. 凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡 3. 色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。 思考下面的问题： 让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？ 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 三、实验结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？ 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？ 三、实验结果分析与评价 总结以下几个问题 1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? 2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么? 3.电泳的作用及其原理是什么? 4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? 5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行 蛋白质的分离有什么意义? 血 红 蛋 白 的 取 和 分 离 凝胶色谱法 原 理 分离过程 凝胶电泳法 缓冲溶液 组 成 作 用 蛋白质的 提取分离 样品处理 粗 分 离 纯 化 纯度鉴定 血 红 蛋 白 的 提 取 和 离 蛋白质分子的差异性 蛋白质分子的差异性 凝胶色谱法 原 理 分离过程 凝胶电泳法 凝胶色谱法 原 理 分离过程 凝胶电泳法 缓冲溶液 组 成 作 用 缓冲溶液 组 成 作 用 蛋白质的