19-21学时 实验五 细菌计数、大小测定、运动观察.docVIP

黔南民族师范学院《微生物学实验》 课程教案 NO:19-21学时 2014年4月14日 第7周 周1 5～7学时 第一实验楼微生物实验室 授课题目 实验五 微生物大小测定、显微镜直接计数和悬滴观察 课时安排 3学时 教学 目的 要求 1．学习并掌握利用显微测微尺测量微生物大小的方法； 2．学习并掌握利用血球计数板测定微生物细胞数的原理和方法； 3．学习并掌握微生物的悬滴观察方法 4. 巩固显微镜使用技术。 教学重点难点 学习重点：细菌革兰氏染色的原理和方法。 学习难点：革兰氏染色关键技术的掌握。 教 学 内 容 及 时 间 安 排 方法及手段 1 显微测微尺测量微生物细胞大小； 2 血球计数板测定微生物细胞数 3 微生物的悬滴观察 实践教学 作业布置： 按要求完成实验报告。 备注： 实验五 微生物大小测定、显微镜直接计数和悬滴观察 1 目的要求 1.1 学习并掌握微生物细胞大小测定的原理和方法； 1.2 学习并掌握利用血球计数板测定微生物细胞数的原理和方法； 1.3 学习并掌握悬滴法观察细菌的运动。 2 原理 2.2 显微测微尺测量微生物大小的原理 因为微生物的个体通常只在显微镜下可见，所以其大小测量也应在显微镜下进行。用来测量微生物大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺专用于校正目镜测微尺每格的长度，是中央部分刻有精确等分线的载玻片。全长1mm，等分为100小格，每一小格长为10μm，见图5-3。目镜测微尺的刻度刻在一个略小于目镜内径的圆玻璃片上，有等分50小格和100小格两种，每5小格间有一长线相隔。当将此测微尺放在目镜内观察物象时，可同时看见物象和测微尺，但是在配合不同放大倍数的物镜时，目镜测微尺每刻度间的长度会发生变化。所以，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，使用前必须利用镜台测微尺进行校正。 图5-1 用镜台测微尺校正目镜测微尺 2.2 血球计数板测定微生物细胞数的原理 计算单位体积内微生物细胞数目的方法很多，有平皿培养法、光密度法、血球计数法等，其中后者具有直观、简便和快速等优点。其原理是：将经过适当稀释的菌体细胞或孢子悬液，加到血球计数板的计数室内，在显微镜下逐格计数。因为计数室的容积是固定的（0.1mm3），所以可将在显微镜下计得的细胞数（菌数或孢子数）换算成单位体积试样中的菌数。由此法得到的是死菌和活菌的总数。血球计数板是一块特制的载玻片，中部有H形的沟槽将中部分成上下两个计数室。如图5-2所示。计数室方格的边长为3mm，每个方格分为9个大方格，正中央的大方格被分为25个中方格，每个中方格又被分为16个小方格（有的大方格被分为16个中方格，每个中方格又被分为25个小方格），无论哪种规格的计数板正中央的大方格都分成400个小方格（图5-3）。1个大方格的边长为1mm，则每个大方格的面积为1mm2,盖上盖玻片计数室的高度为0.1mm，即计数室的容积为0.1mm3（10-4mL）。 计数时，一般数5个中方格的总菌数，计算每个中方格的平均数，再乘以25或16（25或16个中方格），得到一个大方格中的总菌数，然后再换算成1mL菌液中的总菌数。计算公式如下（25个中方格为例）： 1mL菌液中的总菌数（个）= 5个中方格中的总菌数/5×25×104×稀释倍数 图5-2 血球计数板的构造 a.平面图（中间平台分为两半，各有一个计数室） 图5-3 血球计数板中央大方格的刻度 b.侧面图（中间平台与盖玻片之间有高度为0.1mm的间隙） （25中格×16小格） 2.3 悬滴法观察细菌的运动 用凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌悬液，并轻轻盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后反转凹玻片，使菌液恰好悬在凹槽中央，细菌可在其中自由运动。 3 材料与器具 3.1 菌种 （1）金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） （2）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） （3）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） （4）苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis） （5）十字花科软腐病菌（Erwinia aroideae） （6）大肠杆菌（Escherichia coli） （7）坚黑粉菌（Ustilago hordei） 3.2 其它 血球计数板，显微目镜测微尺,显微镜台测微尺，凹玻片，凡士林，盖玻片，无菌滴管，吸水纸，擦镜纸，振荡器。 4 内容及方法步骤 4.1 显微测微尺测量微生物大小 （1）校正目镜测微尺： ①安装目镜测微尺：取出目镜，旋开透镜螺旋，将目镜测微尺刻度朝下放入目镜筒